服務(wù)簡介

酵母是一種單細(xì)胞低等真核生物,，培養(yǎng)條件普通,，生長繁殖速度迅速，能夠耐受較高的流體靜壓,，用于表達(dá)基因工程產(chǎn)品時(shí),，酵母具有與其他真核生物類似的蛋白質(zhì)分泌途徑，外源基因的分泌表達(dá),，不僅方便了表達(dá)產(chǎn)物的分離純化,，同時(shí)也和表達(dá)產(chǎn)物的翻譯后加工有關(guān)。酵母表達(dá)系統(tǒng)由于兼具原核以及真核表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn),，因此利用此系統(tǒng)可高水平表達(dá)蛋白,。常用的表達(dá)系統(tǒng)有釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)和甲醇酵母表達(dá)系統(tǒng)，而甲醇酵母表達(dá)系統(tǒng)較為常見,，以畢赤酵母屬(Pichia)應(yīng)用較多,。

釀酒酵母(Saecharomycescerevisiae)被認(rèn)為是安全性生物，不產(chǎn)生毒素,，但釀酒酵母難于高密度培養(yǎng),，分泌效率低，幾乎不分泌分子量大于30 kD的外源蛋白質(zhì),，也不能使所表達(dá)的外源蛋白質(zhì)正確糖基化，而且表達(dá)蛋白質(zhì)的C端往往被截短,。因此,，一般不用釀酒酵母做重組蛋白質(zhì)表達(dá)的宿主菌。甲醇酵母表達(dá)系統(tǒng)是應(yīng)用較多,，甲醇酵母主要有漢森酵母屬(Hansenula),，畢赤酵母屬(Pichia)，球擬酵母屬(Torulopsis)等,，并以畢赤酵母屬(Pichia)應(yīng)用為主,。利用甲醇酵母表達(dá)外源性蛋白質(zhì)其產(chǎn)量往往可達(dá)克級(jí)，與釀酒酵母相比其翻譯后的加工更接近哺乳動(dòng)物細(xì)胞,，不會(huì)發(fā)生超糖基化,。

酵母表達(dá)系統(tǒng)是研究真核蛋白質(zhì)表達(dá)和分析的有力工具，一是含有*的強(qiáng)有力的AOX (醇氧化酶基因)啟動(dòng)子,用甲醇可嚴(yán)格地調(diào)控外源基因的表達(dá)。二是培養(yǎng)成本低,，產(chǎn)物易分離,，畢赤酵母所用發(fā)酵培養(yǎng)基成本合理，一般碳源為甘油或葡萄糖及甲醇,，期為無機(jī)鹽,，培養(yǎng)基中不含蛋白，有利于下游產(chǎn)品分離純化,。三是外源蛋白基因遺傳穩(wěn)定,，外源基因能以高拷貝數(shù)整合到畢赤酵母基因組中，不易丟失并能得到高表達(dá)菌株,。四是作為真核表達(dá)系統(tǒng),，畢赤酵母具有真核生物的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，具有糖基化,、脂肪?；⒌鞍琢姿峄确g后修飾加工功能,。

服務(wù)內(nèi)容

百歐泰生物的酵母分泌表達(dá)系統(tǒng)采用的宿主是巴氏畢赤酵母(Pichia pastoris),，該表達(dá)系統(tǒng)是近年來發(fā)展迅速、應(yīng)用較多的一種真核表達(dá)系統(tǒng),。百歐泰生物酵母分泌表達(dá)系統(tǒng)服務(wù)項(xiàng)目包括：

①重組酵母表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建,；

②重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化；

③重組表達(dá)子篩選,；

④小規(guī)模蛋白表達(dá)和純化（24培養(yǎng)基培養(yǎng)產(chǎn)物）,。

實(shí)驗(yàn)原理

以巴斯德畢赤酵母表達(dá)外源基因?yàn)槔叧嘟湍钢泻袃蓚€(gè)乙醇氧化酶（Alcohol oxidase, AOX）分別編碼基因AOX1和AOX2,，兩種序列相似,。AOX1基因嚴(yán)格受甲醇誘導(dǎo)和調(diào)控。當(dāng)甲醇為碳源時(shí),，AOX1啟動(dòng)子可被甲醇誘導(dǎo),，啟動(dòng)乙醇氧化酶的表達(dá)，從而用甲醇進(jìn)行代謝,。甲醇酵母的表達(dá)載體為整合型質(zhì)粒,，載體中含有與酵母染色體中同源的序列，很容易整合到酵母基因組中,，大部分甲醇酵母的表達(dá)載體（質(zhì)粒）中都有甲醇酵母醇氧化酶基因（AOX1）,，在該基因啟動(dòng)子(PAOX1)作用下，質(zhì)?？捎脕泶龠M(jìn)編碼外源蛋白的目的基因的表達(dá),。

實(shí)驗(yàn)流程

?將目的基因克隆入畢赤酵母表達(dá)載體,，收獲陽性重組表達(dá)質(zhì)粒；

?用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶消化陽性重組質(zhì)粒,，使之線性化,；

?將線性化的陽性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化人巴斯德畢赤酵母菌株（如GS1 15，KM71）,；

?將轉(zhuǎn)化物接種HIS4缺陷平板進(jìn)行初次篩選,；

?用不同濃度的G418平板進(jìn)行第二輪篩選；

?挑選10~20個(gè)克隆進(jìn)行小規(guī)模誘導(dǎo)培養(yǎng),，鑒定外源基因的表達(dá)量,；

?挑選高水平表達(dá)菌株進(jìn)行大規(guī)模誘導(dǎo)培養(yǎng)以制備外源基因的表達(dá)蛋白質(zhì)。

實(shí)驗(yàn)服務(wù)流程

雙方溝通一致后確定實(shí)驗(yàn)方案,，確定服務(wù)要求-簽訂合同—預(yù)付款-開始實(shí)驗(yàn)-成果交付

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