細(xì)胞計(jì)數(shù)儀驗(yàn)證

1．細(xì)胞計(jì)數(shù)儀概述

細(xì)胞計(jì)數(shù)儀是用來進(jìn)行細(xì)胞濃度檢測(cè)的儀器,，目的是為了明確培養(yǎng)的細(xì)胞在某一時(shí)間段的密度,，及時(shí)補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)液，以便其能夠良好生長(zhǎng),，一般以每毫升細(xì)胞數(shù)（細(xì)胞/ml）來表示計(jì)數(shù)結(jié)果。那么這就需要測(cè)量死細(xì)胞和活細(xì)胞的濃度,，在細(xì)胞中,，細(xì)胞死亡是正常的，總細(xì)胞數(shù)中活細(xì)胞所占的百分比稱為細(xì)胞活力,，也可叫做存活率,。對(duì)細(xì)胞活力的應(yīng)用可用于對(duì)復(fù)蘇后細(xì)胞凍存和復(fù)蘇效果的檢測(cè)，也可用于在組織中對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分離時(shí)是否存在損傷的檢測(cè)?，F(xiàn)在常用的對(duì)細(xì)胞死活的辨別方法是通過使用臺(tái)盼藍(lán),，臺(tái)盼藍(lán)染色的原理是活細(xì)胞不會(huì)被染色，而死細(xì)胞能夠染色,，另一個(gè)是熒光染色法來鑒別,。細(xì)胞計(jì)數(shù)儀有兩個(gè)重要的功能，一個(gè)是計(jì)數(shù),，另一個(gè)就是對(duì)細(xì)胞是否死亡的判斷,。目前市場(chǎng)上有兩類細(xì)胞計(jì)數(shù)儀：一類是明場(chǎng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀僅需簡(jiǎn)單的臺(tái)盼藍(lán)染色，另一類是熒光場(chǎng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀,，需要相應(yīng)的熒光染料,。

2．細(xì)胞計(jì)數(shù)儀的原理

(1)   臺(tái)盼藍(lán)染色原理（明場(chǎng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀）：臺(tái)盼藍(lán)是細(xì)胞跨膜染料,，活細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整，臺(tái)盼藍(lán)無法通過,，細(xì)胞呈中心透亮具有明顯的輪廓,。死細(xì)胞膜通透性改變,，臺(tái)盼藍(lán)可跨過死細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，使細(xì)胞顏色加深,，呈現(xiàn)實(shí)心的圓點(diǎn)與活細(xì)胞中心透亮輪廓清晰有明顯的差異,，根據(jù)這種形態(tài)的差異可以明顯區(qū)別活細(xì)胞和死細(xì)胞進(jìn)行區(qū)別計(jì)數(shù)。

(2)  AO/PI 熒光染色原理（暗場(chǎng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀）：AO/PI 為細(xì)胞核染料,，AO 為吖啶橙是一種小分子染料，可以跨過所有細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),，使有核細(xì)胞標(biāo)記上綠色熒光。PI 是碘化丙啶一種大分子染料,，只有細(xì)胞死亡膜通透性改變后才能跨膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),，使死細(xì)胞的核標(biāo)記上紅色熒光,。AO/PI 染細(xì)胞后，死細(xì)胞會(huì)同時(shí)染上 AO 和 PI,，AO 的發(fā)射光波長(zhǎng) 532 nm 左右,，PI 的激發(fā)光波長(zhǎng)剛好與 AO 發(fā)射光波長(zhǎng)相重，兩種染料同染上死細(xì)胞核時(shí)會(huì)發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移,，AO 的發(fā)射光被 PI 吸收，所以死細(xì)胞只會(huì)顯示紅色熒光,，而活細(xì)胞只有綠色熒光。因此,，通過特異性染色的細(xì)胞上標(biāo)記的紅色熒光和綠色熒光就可以快速辨別出死細(xì)胞和活細(xì)胞,。

注：AO/PI試劑由可以發(fā)出綠色熒光的DNA結(jié)合染料吖啶橙（AcridineOrange，簡(jiǎn)稱AO）和可以發(fā)出紅色熒光的DNA結(jié)合染料碘化丙啶（Propidiumiodide,，簡(jiǎn)稱PI）組成,。

3．為什么細(xì)胞計(jì)數(shù)儀要做驗(yàn)證呢？

首先應(yīng)該明確做驗(yàn)證的目的,，就是為了保證使用的儀器檢測(cè)出的結(jié)果數(shù)據(jù)準(zhǔn)確,、可信,。細(xì)胞計(jì)數(shù)儀是用來檢測(cè)細(xì)胞數(shù)目的儀器，對(duì)其準(zhǔn)確度要求很高,，比如它的重復(fù)復(fù)現(xiàn)結(jié)果的能力,、穩(wěn)定性等等,。新儀器使用前以及儀器使用一段時(shí)間后都需要對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證，保證檢測(cè)細(xì)胞數(shù)目的結(jié)果準(zhǔn)確,、可信,，就必須對(duì)它的安裝,、環(huán)境等各部分系統(tǒng)要求進(jìn)行驗(yàn)證，以證明該儀器符合檢測(cè)的目的和要求,，產(chǎn)生的誤差也在規(guī)定范圍內(nèi),。那么儀器驗(yàn)證就是對(duì)儀器各功能進(jìn)行檢測(cè),、驗(yàn)證使其滿足使用者的要求。這就需要通過設(shè)計(jì)合理的預(yù)試驗(yàn)來驗(yàn)證該儀器是否符合檢測(cè)樣品的規(guī)定要求,，復(fù)現(xiàn)性怎么樣、準(zhǔn)確度會(huì)不會(huì)有偏移,，結(jié)果是否可信等,。所以儀器驗(yàn)證就是為了保證所檢測(cè)出的結(jié)果是否可信、準(zhǔn)確,，這是很有必要的,，只有經(jīng)過驗(yàn)證的儀器,，確保該儀器各部分都在良好的情況下才能用于細(xì)胞數(shù)目的檢測(cè)。

4．細(xì)胞計(jì)數(shù)儀驗(yàn)證項(xiàng)目

（1）安裝確認(rèn)

a.文件確認(rèn)

b.附件確認(rèn)

c.安裝環(huán)境確認(rèn)

d.安裝情況確認(rèn)

（2）運(yùn)行功能確認(rèn)

a.運(yùn)行功能確認(rèn)

b.軟件控制功能測(cè)試

（3）性能確認(rèn)

a. 準(zhǔn)確度測(cè)試

b. 線性關(guān)系測(cè)試

c. 重復(fù)性測(cè)試

d. 細(xì)胞活率判定測(cè)試

5．注意事項(xiàng)

(1 ) 每次使用前檢查檢出室或檢出器細(xì)孔是否被污染,，檢出器細(xì)孔是否被損壞，細(xì)胞計(jì)數(shù)定量隔膜泵和檢出器之間的管道是否堵塞等,；

(2) 取樣計(jì)數(shù)前,，充分混勻細(xì)胞懸液，使分散成單個(gè)細(xì)胞,；

(3)  如果感覺細(xì)胞數(shù)量較多時(shí),，可以從細(xì)胞懸液中吸取10μL至100μL，用少量PBS稀釋后再作計(jì)數(shù),；

(4) 上機(jī)前注意檢查是否有氣泡,，也不能讓懸液流入旁邊槽中,；

(5) 所用的稀釋器,、吸樣管要經(jīng)過校準(zhǔn),；

(6) 檢測(cè)前試樣混勻很重要,，如果無旋轉(zhuǎn)式混勻器應(yīng)顛倒混勻至少8次；

公司背景介紹：

澤恒.華譜在計(jì)量校準(zhǔn),、驗(yàn)證與確認(rèn)的優(yōu)勢(shì)是專注做生物制藥質(zhì)控服務(wù)，針對(duì)一些特殊的儀器都非常熟悉,，核心團(tuán)隊(duì)來源于制藥公司和儀器廠家,，對(duì)儀器和GMP法規(guī)都很熟悉,，比如：我們團(tuán)隊(duì)專門研發(fā)了替代進(jìn)口的熒光定量PCR儀校準(zhǔn)裝置，大大降低熒光定量/定性PCR儀校準(zhǔn)的成本（遠(yuǎn)低于同行）,；我們開發(fā)了細(xì)胞計(jì)數(shù)儀的校準(zhǔn)內(nèi)部規(guī)程；開發(fā)了細(xì)胞復(fù)蘇儀的內(nèi)部校準(zhǔn)規(guī)程,；開發(fā)了凝膠電泳掃描儀的校準(zhǔn)規(guī)程；我們開發(fā)了溫度驗(yàn)證所需要的超低溫和超高溫一體化無線探頭,，降低用戶大量使用探頭時(shí)的成本，代替了進(jìn)口,；這些例子還有很多,，因?yàn)槲覀兌际巧锍錾恚晕覀冴P(guān)注每一個(gè)生物用戶工藝要求,，在生物制藥儀器設(shè)備上面專注，“與質(zhì)量同行、做儀器設(shè)備質(zhì)控”,，為了讓生物制藥更安全而努力。

我們?cè)诜?wù)上與其它單位密切合作,，包括強(qiáng)檢、特檢或做不了的都幫客戶代送代取,，省時(shí),、省力,、方便客戶,。

澤恒.華譜是專注于為生物制藥行業(yè)提供實(shí)驗(yàn)室儀器計(jì)量校準(zhǔn)、儀器設(shè)備驗(yàn)證與驗(yàn)證/廠房驗(yàn)證的專業(yè)服務(wù)商,。我們給制藥客戶解決的是一站式QC/QA/工程部/驗(yàn)證部/生產(chǎn)部的質(zhì)控外包服務(wù)。