分子克隆實(shí)驗(yàn)與質(zhì)粒載體構(gòu)建

一,、服務(wù)介紹

分子克隆實(shí)驗(yàn)是在分子水平上提供一種純化和擴(kuò)增特定DNA的片段的方法,。常含有目的基因，用體外重組方法將它們插入克隆載體,，形成重組克隆載體,，通過(guò)轉(zhuǎn)化與轉(zhuǎn)導(dǎo)的方式，引入適合的寄主體內(nèi)得到復(fù)制與擴(kuò)增,，然后再?gòu)暮Y選的寄主細(xì)胞內(nèi)分離提純所需的克隆載體,，可以得到插入DNA的許多拷貝，從而獲得目的基因的擴(kuò)增,。

 二,、實(shí)驗(yàn)原理

外源DNA與載體分子的連接就是DNA重組，這樣重新組合的DNA叫做重組體或重組子,。重組的DNA分子是在DNA連接酶的作用下,有Mg2+,、ATP存在的連接緩沖系統(tǒng)中，將分別經(jīng)酶切的載體分子與外源DNA分子進(jìn)行連接,。DNA連接酶有兩種：T4噬菌體DNA連接酶和大腸桿菌DNA連接酶,。兩種DNA連接酶都有將兩個(gè)帶有相同粘性末端的DNA分子連在一起的功能,，而且T4噬菌體DNA連接酶還有—種大腸桿菌連接酶沒(méi)有的特性，即能使兩個(gè)平末端的雙鏈DNA分子連接起來(lái),。但這種連接的效率比粘性末端的連接效率低,，一般可通過(guò)提高T4噬菌體DNA連接酶濃度或增加DNA濃度來(lái)提高平末端的連接效率。

 T4噬菌體DNA連接酶催化DNA連接反應(yīng)分為3步：,，T4DNA連接酶與輔助因子ATP形成酶—AMP復(fù)合物,；然后，酶—AMP復(fù)合物再結(jié)合到具有5’磷酸基和3’羥基切口的DNA上,，使DNA腺苷化,；后產(chǎn)生一個(gè)新的磷酸二酯鍵，把切口封起來(lái),。

 DNA重組的方法主要有粘端連接法和平端連接法,，為了防止載體本身的自連，可以通過(guò)(牛小腸堿性磷酸酶)CIP處理克服,。

 連接反應(yīng)的溫度在37℃時(shí)有利于連接酶的活性.但是在這個(gè)溫度下,，粘性末端的氫鍵結(jié)合是不穩(wěn)定的。因此人們找到了一個(gè)折中溫度,，即12-16℃,，連接12-16h(過(guò)夜)，這樣既可大限度地發(fā)揮連接酶的活性,，又兼顧到短暫配對(duì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定,。

三、實(shí)驗(yàn)流程

目的DNA的擴(kuò)增和純化,；

連接反應(yīng),；

電泳檢測(cè)連接產(chǎn)物。

四,、客戶提供

樣本DNA,，基因序列，試劑盒,。

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