小鼠游離膽固醇（FC）ELISA 技術(shù)試劑盒

　　試劑盒采用雙抗體夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）。往預(yù)先包被小鼠游離膽固醇（FC）捕獲抗體的包被微孔中,，依次加入標(biāo)本,、標(biāo)準(zhǔn)品、HRP標(biāo)記的技術(shù)抗體,，經(jīng)過溫育并*洗滌,。用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色,，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的小鼠游離膽固醇（FC）呈正相關(guān),。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度（OD值）,，計(jì)算樣品濃度。

樣品收集,、處理及保存方法

　　1.血清：使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管,，操作過程中避免任何細(xì)胞刺激，收集血液后,，3000轉(zhuǎn)離心10分鐘將血清和紅細(xì)胞迅速小心地分離,。

　　2.血漿：EDTA、檸檬酸鹽或肝素抗凝,。3000轉(zhuǎn)離心30分鐘取上清,。

　　3.細(xì)胞上清液：3000轉(zhuǎn)離心10分鐘去除顆粒和聚合物。

　　4.組織勻漿：將組織加入適量生理鹽水搗碎,。3000轉(zhuǎn)離心10分鐘取上清,。

　　5.保存：如果樣本收集后不及時(shí)技術(shù)，請(qǐng)按一次用量分裝,，凍存于-20℃,，避免反復(fù)凍融,，在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。

　　自備物品

　　1.酶標(biāo)儀（450nm）

　　2.高精度加樣器及槍頭：0.5-10uL,、2-20uL,、20-200uL、200-1000uL

　　3.37℃恒溫箱

　　小鼠游離膽固醇（FC）ELISA技術(shù)試劑盒

　　操作注意事項(xiàng)

　　1.試劑盒保存在2-8℃,，使用前室溫平衡60分鐘,。從冰箱取出的濃縮洗滌液會(huì)有結(jié)晶，這屬于正?，F(xiàn)象,，水浴加熱使結(jié)晶*溶解后再使用。樣本在使用前也要在室溫平衡60分鐘,。

　　2.實(shí)驗(yàn)中不用的板條應(yīng)立即放回自封袋中,，密封（低溫干燥）保存。

　　3.預(yù)處理后的樣本無需稀釋,，直接取10μL加樣即可,。

　　4.嚴(yán)格按照說明書中標(biāo)明的時(shí)間、加液量及順序進(jìn)行溫育操作,。

　　5.所有液體組分使用前充分搖勻,。

　　試劑盒組成

　　名稱96孔配置48孔配置備注

　　微孔酶標(biāo)板12孔×8條12孔×4條無

　　標(biāo)準(zhǔn)品0.3mL0.3mL無

　　樣本稀釋液6mL3mL無

　　技術(shù)抗體-HRP10mL5mL無

　　20×洗滌緩沖液25mL15mL按說明書進(jìn)行稀釋

　　底物A6mL3mL無

　　底物B6mL3mL無終止液6mL3mL無

　　封板膜2張2張無

　　說明書1份1份無

　　自封袋1個(gè)1個(gè)無

　　注：標(biāo)準(zhǔn)品濃度依次為：2000、1000,、500,、250、125,、0μmol/L.

　　試劑的準(zhǔn)備

　　20×洗滌緩沖液的稀釋：蒸餾水按1：20稀釋,，即1份的20×洗滌緩沖液加19份的蒸餾水。

　　洗板方法

　　1.手工洗板：甩盡孔內(nèi)液體,，每孔加滿洗滌液,，靜置1min后甩盡孔內(nèi)液體，在吸水紙上拍干,，如此洗板5次,。

　　2.自動(dòng)洗板機(jī)：每孔注入洗液350μL，浸泡1min,，洗板5次,。

　　小鼠游離膽固醇（FC）ELISA 技術(shù)試劑盒操作步驟

　　1.從室溫平衡60min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃,。

　　2.設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔,，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μL；

　　3.待測樣本孔先加待測樣本10μL,，再加樣本稀釋液40μL,；

　　4.隨后標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的技術(shù)抗體100μL,，用封板膜封住反應(yīng)孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min,。

　　5.棄去液體,，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液,，靜置1min,，甩去洗滌液，吸水紙上拍干,，如此重復(fù)洗板5次（也可用洗板機(jī)洗板）,。

　　6.每孔加入底物A、B各50μL,，37℃避光孵育15min,。

　　7.每孔加入終止液50μL，15min內(nèi),，在450nm波長處測定各孔的OD值,。

　　結(jié)果判斷

　　繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：在Excel工作表中，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度作橫坐標(biāo),，對(duì)應(yīng)OD值作縱坐標(biāo),，繪制出標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸曲線，按曲線方程計(jì)算各樣本濃度值,。

　　試劑盒性能

　　1.準(zhǔn)確性：標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R值,，大于等于0.9900。

　　2.靈敏度：技術(shù)濃度小于10μmol/L,。

　　3.特異性：不與其它可溶性結(jié)構(gòu)類似物交叉反應(yīng),。

　　4.重復(fù)性：板內(nèi)變異系數(shù)小于10%、板間變異系數(shù)小于15%,。

　　5.貯藏：2-8℃,，避光防潮保存,。

　　6.有效期：6個(gè)月

　　免責(zé)聲明

　　1.試劑盒僅供研究使用,，不得用于臨床實(shí)驗(yàn)或人體實(shí)驗(yàn)，否則所產(chǎn)生的一切后果,，由實(shí)驗(yàn)者承擔(dān),，本公司概不負(fù)責(zé)。

　　2.嚴(yán)格按照說明書操作,，實(shí)驗(yàn)者違反說明書操作,，后果由實(shí)驗(yàn)者承擔(dān)。

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