石蠟包埋組織切片免疫染色實(shí)驗(yàn)步驟 

實(shí)驗(yàn)步驟（建議方案）：

石蠟包埋組織切片3~4μm 厚度

1.烤片： 將待做切片置于切片架上，于60℃恒溫烤箱中至少烤1 hr,；

2.脫蠟： 切片放入盛有二甲本苯的容器中脫蠟3次（即二甲本苯Ⅰ,、Ⅱ、Ⅲ）,，每次10 min,；

3.水化： 切片經(jīng)下行酒精水化，無(wú)水乙醇5min,，95%乙醇2次（每次2min）,，85%乙醇2 min；75%乙醇2min,，自來(lái)水沖洗,，ddH2O洗2×2min；

4.抗原修復(fù)： 根據(jù)抗體說(shuō)明書(shū)推薦方法進(jìn)行抗原修復(fù)，常采用高壓,、微波（溫度達(dá)到98~100℃）或酶消化修復(fù)法,，室溫自然冷卻，自來(lái)水沖洗,，ddH2O洗2×2min,，TBS洗滌（2×2min）（具體修復(fù)方法見(jiàn)附1）* 注：有些抗原勿需修復(fù)，直接進(jìn)入第5步封閉,。

5.封閉： 滴加試劑B，37℃濕盒孵育30 min,；

6.加一抗：滴加用試劑C（即用型一抗）,，37℃濕盒孵育2 hr 或4℃過(guò)夜；

7.洗滌： TBS-T洗滌（3×5 min）,；

8.封閉： 滴加試劑B,，37℃濕盒孵育10 min；

9.加二抗： 滴加用抗體稀釋液稀釋的生物素化二抗（試劑D）,，37℃濕盒中孵育30 min,；

10.洗滌： TBS-T洗滌（3×5 min）；

11.封閉： 滴加試劑Tween 20,，37℃濕盒孵育封閉20 min,；

12.加HRP-SA： 滴加用抗體稀釋液稀釋的試劑E（1：50~200，終濃度5~20 nM）,，37℃濕盒中孵育30 min,；

13.洗滌： TBS-T洗滌（3×5 min），TBS洗滌（2×5 min）,；

14.顯色：應(yīng)用DAB溶液（試劑F）顯色,；

15.復(fù)染：自來(lái)水充分沖洗，復(fù)染,，脫水,，透明；

16.封片： 待組織標(biāo)本干后,，用試劑緩沖甘油封固劑封片,；

17.觀察成像： 顯微鏡下觀察成像。

注意事項(xiàng)：

1. 修復(fù)后緩沖液須自然冷卻,，自來(lái)水沖洗后方能把切片取出,，驟冷有可能導(dǎo)致結(jié)晶或抗原封閉。

2. 緩沖液的量必須保證所有切片都能浸泡到,，用過(guò)的檸檬酸緩沖液不能反復(fù)使用,。

3. 若試劑為微量濃縮液，用前應(yīng)低速離心，將內(nèi)蓋和管壁附著的溶液離到底部,。

4. 封片前一定要換用TBS充分洗滌,，以便洗去組織上殘留的Tween 20，否則會(huì)影響結(jié)果觀察,。

5. 如須復(fù)染細(xì)胞核,，則在封片前復(fù)染或直接采用含有染核試劑的封片劑進(jìn)行封片。

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