Cellulose DE-52 DEAE 纖維素 DE-52

產(chǎn)品信息：  

    纖維素DE-52為中等堿性陰離子交換劑,，柱層析用于吸附劑，用以分離提純多糖,、肽,、核苷酸、酶,、血清組分和病毒等各種生物高分子,。

纖維素DE-52提取法純化多克隆抗體

該法提取IgG簡便，既可小量提取,，也可大量制備,。

1．批量提取法 稱取DEAE-纖維素(DE52)50g，置于1000ml燒杯中,，先以蒸餾水漂浮除去細(xì)顆粒,，再經(jīng)酸堿處理后，用0.01～0.05mol/L,，pH8.0左右的磷酸鹽緩沖液(PB)平衡,。將水分抽干，或用布氏濾斗(內(nèi)放兩層濾紙)過濾,，收集濕纖維素,，以降低其離子強(qiáng)度。按1ml血清加濕重5g DE52,，經(jīng)過充分?jǐn)嚢?，?℃吸附1h。上清液可再如此處理一次,，即獲得較純的IgG,。該法提取IgG簡便，既可小量提取，也可大量制備,。

2．Tris-Cl離子交換層析法(Ion-exchange chromatography)

【材料和試劑】

（1）DE52纖維素,。

（2）HCl；NaOH,；0.01～0.05mol/L,，pH8.0 PB；0.01mol/L,，pH8.6 Tris-Cl,；0.5mol/L NaCl。

（3）待純化標(biāo)本：雜交瘤腹水或培養(yǎng)上清,，免疫血清或飽和硫酸銨粗提品,。

（4）1.5×50cm 層析柱；透析袋,；紫外分光光度計(jì)及其他透析和層析所需的試劑和器材,。

【操作步驟】   Cellulose DE-52 DEAE 纖維素 DE-52

（1）DE52纖維素的處理：DE52經(jīng)酸、堿處理,，0.01mol/L,，pH8.6 Tris-Cl平衡。

（2）裝柱：將層析柱固定于滴定架上,，柱底墊一圓形尼龍紗,，出口接一細(xì)塑料管并關(guān)閉出水。將浸泡于0.01mol/L,，pH8.6 Tris-Cl中的DE52沿玻璃棒倒入柱中,，待DE52自然沉降3～5cm高時(shí)，吸除0.01mol/L,，pH8.6 Tris-Cl,，或松開出水口螺旋夾，控制流速1～2ml/min,，同時(shí)連續(xù)加入DE52至所需高度,。待DE52*沉降后，柱面放一圓形濾紙片,。

（3）平衡：松開出水口螺旋夾,，以0.01mol/L，pH8.6 Tris-Cl平衡,，控制流速為15滴/min,，待流出液與洗脫液之pH值達(dá)到*時(shí)，停止平衡,。

（4）待提取樣品的準(zhǔn)備：將蛋白裝入透析袋里,，置4℃冰箱,，對(duì)0.01mol/L pH8.6 Tris-Cl透析。

（5）加樣,、洗脫與收集：用吸管吸去柱面液體,，以毛細(xì)吸管沿柱壁加入樣品，樣品體積相當(dāng)于柱床體積的1%～2%,，蛋白濃度為50～70mg,。啟開出水口螺旋夾使樣品緩慢進(jìn)入柱床內(nèi)，并用少量洗脫液清洗柱壁,；待液體進(jìn)入柱床后,，以0.01mol/L，pH8.6 Tris-Cl洗脫,，控制流速為14～16滴/min,。分部收集器收集,，紫外監(jiān)測(cè),，或人工收集，以紫外分光光度計(jì)分別測(cè)定每管280nm OD值,，描繪洗脫液峰,。

（6）濃縮：將洗脫液的280nm OD上峰段與下峰段各管分別合并，裝入透析袋,，以PEG濃縮至所需體積,。

Tris-PO4離子交換層析法

該法在上述方法的基礎(chǔ)上稍加改良，即通過梯度洗脫,，可用于血清中IgG和IgM的提取,。

【材料和試劑】     

（1）DE52纖維素。

（2）待純化標(biāo)本：雜交瘤腹水或培養(yǎng)上清,，免疫血清或飽和硫酸銨粗提品,。

（3）1.5×50cm 層析柱；透析袋及其他透析和層析所需的試劑和器材,。

（4）梯度洗脫液包括：0.005 mol/L,，pH8.6 Tris-PO4；0.055mol/L,，pH6.0 Tris-PO4,；.5mol/L，pH5.1 Tris-PO4,。

【操作步驟】

（1）蛋白標(biāo)本對(duì)0.005mol/L,，pH8.6 Tris-PO4透析。

（2）DE52裝柱,，并以0.005mol/L,，pH8.6 Tris-PO4平衡,。

（3）加樣，以0.005mol/L,，pH8.6 Tris-PO4洗脫,，紫外監(jiān)測(cè)直至洗脫液280nm OD回到基線。這一步驟可除去血清中其他蛋白,。

（4）以350ml 0.055mol/L,，pH6.0 Tris-PO4洗脫，這一步驟可用于純化血清IgG和IgM,。

（5）以125ml 0.055mol/L,，pH6.0 Tris-PO4和125ml 0.5mol/L，pH5.1 Tris-PO4梯度洗脫,，總量收集250ml,；重復(fù)步驟（5）。

（6）根據(jù)280nm峰值合并蛋白峰,，透析濃縮和保存同上,。

用過的DE52可用0.01mol/L，pH8.6 Tris-Cl和0.5mol/L NaCl,、0.01mol/L,，pH8.6 Tris-Cl梯度洗脫回收。再用蒸餾水洗至中性,，加入0.02%疊氮鈉于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

性質(zhì)用途

性狀：干燥細(xì)結(jié)晶或纖維狀

基質(zhì) 高度交聯(lián)纖維素

配基 二乙基氨基乙基

配基密度 40μmol /ml

吸附載量 180mg HSA/ml

填料的顆粒大小 50μm

zui大流速 300cm/h

pH范圍 3-10,，在位清洗時(shí)pH范圍可到2-11

化學(xué)穩(wěn)定性 各種緩沖液及鹽，0.5M NaOH及醋酸,，8M脲,，6M鹽酸胍，乙醇,，異丙醇等

物理穩(wěn)定性 0.1M中性緩沖液中,，120℃30min

層析柱裝填

1. 吸附性層析一般建議裝填高度為 10~15cm 高，分子篩建議裝填高度為60~90cm

1）組裝柱（如有需要連接裝柱器）,。

2）取下下柱頭用裝柱緩沖液沖洗柱底適配器,，排除篩網(wǎng)下面的氣泡，將下柱頭安裝

在層析柱底部,，旋緊調(diào)整旋鈕,，并在層析柱底部保留 1cm 左右高度的液體。

3）用裝柱緩沖液重懸介質(zhì),，制成 50%~75%左右的介質(zhì)懸浮液,。

4）一次性將介質(zhì)倒入柱管中，避免產(chǎn)生氣泡,。

5）如連接有裝柱器,，立即往裝柱器中緩慢加入裝柱緩沖液,。將適配器或裝柱器上蓋

與層析系統(tǒng)相連接。

6）設(shè)定所需流速⁺,，打開柱下端,，啟動(dòng)泵，進(jìn)行壓柱,。

7）柱床穩(wěn)定后保持 30min 以上,，關(guān)閉泵和底閥

8）如連接有裝柱器，移除裝柱器后連接適配器,。

9）調(diào)節(jié)適配器,，使其固定在膠面上 0.5~1cm 處，并保證適配器入口充滿液體,。

10）打開底閥,，連接泵，繼續(xù)用設(shè)定的流速（注意壓力不要超過 0.3Mpa）繼續(xù)壓柱

待膠面高度保持不變,，標(biāo)記此時(shí)膠面高度

11）暫停機(jī)器,，關(guān)閉底閥，斷開柱頭入口,，調(diào)低適配器至膠面下 3~5mm 處,。封閉

上柱口，裝柱完成,。