產(chǎn)品名稱(chēng)：無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒小量提取試劑盒
產(chǎn)品編號(hào)：D1140
規(guī)格：50T/100T 
保存：常溫干燥保存,，復(fù)檢期為一年,。
產(chǎn)品說(shuō)明： 
  無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒小量提取試劑盒采用堿裂解法裂解細(xì)胞，根據(jù)離心吸附柱在高鹽狀態(tài)下特異性地結(jié)合溶液中的 DNA 的原理特異性提取質(zhì)粒 DNA,。  離心吸附柱中采用的硅基質(zhì)材料能高效,、專(zhuān)一地吸附 DNA，可大限度去除雜質(zhì)蛋白及細(xì)胞中其他有機(jī)化合物,。 Solarbio 公司研制的內(nèi)毒素清除劑,，可大限度地除去內(nèi)毒素。從 1-5ml 大腸桿菌 L培養(yǎng)液中,，可快速提取 5-15μg 高純度質(zhì)粒 DNA,，提取率達(dá) 85-90%。使用盒提取的質(zhì)粒 DNA 純度高,，可直接用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染等要求較高的實(shí)驗(yàn),，以及其他各種常規(guī)操作，包括酶切,、PCR、測(cè)序,、連接和轉(zhuǎn)化等試驗(yàn)使用前請(qǐng)先在漂洗液中加入無(wú)水乙醇,，加入體積請(qǐng)參照瓶體上的標(biāo)簽。溶液P1在使用前先將試劑盒中提供盒操作步驟: 
1,、取1-5ml細(xì)菌培養(yǎng)物,，12000rpm離心1min，吸除上清（菌液濃度較低時(shí)可多次離心收集到一個(gè)離心管中） ,。
2,、向留有菌體沉淀的離心管中加入200μl溶液P1(請(qǐng)先檢查是否已加入RNaseA） ，使用移液器或旋渦振蕩器*懸浮細(xì)菌細(xì)胞沉淀,。注意：如果菌塊未*混勻,，會(huì)影響裂解導(dǎo)致質(zhì)粒提取量和純度偏低。 
3,、向離心管中加入200ul溶液P2,，溫和地上下翻轉(zhuǎn)6-8次使菌體充分裂解。注意：混勻一定要溫和,，以免污染細(xì)菌基因組DNA,，此時(shí)菌液應(yīng)變得清亮粘稠，作用時(shí)間不要超過(guò)5 min,，以免質(zhì)粒受到破壞,。 
4、 向離心管中加入200ul溶液P3,， 立即溫和地上下翻轉(zhuǎn)6-8次,，充分混勻,，此時(shí)會(huì)出現(xiàn)白色絮狀沉淀。 12000rpm的RNaseA全部加入,，混勻,，置于 2-8℃保存。如非指明,，所有離心步驟均為使用臺(tái)式離心機(jī)在室溫下離心,。離心10 min，用移液器小心地將上清轉(zhuǎn)移到另一個(gè)干凈的離心管中,，盡量不要吸出沉淀,。注意：溶液P3加入后應(yīng)立即混合，避免產(chǎn)生局部沉淀,。如果上清中還有微小白色沉淀,，可再次離心后取上清。 
5,、加入上清1/5體積的冰上預(yù)冷的內(nèi)毒素清除劑,，振蕩混勻，溶液變渾濁,，冰浴2min至溶液變清亮,。 
6、37℃水浴5min,不時(shí)振蕩,，溶液又變渾濁,。12000rpm室溫離心5min，溶液應(yīng)分為兩相,，上層水相含質(zhì)粒DNA,，下層油相含內(nèi)毒素。 
7,、將含質(zhì)粒DNA的上層水相轉(zhuǎn)移至新管,，棄下層油相，注意不要吸入油狀相,。重復(fù)步驟5-7三次,。 
8、加入600ul的結(jié)合液,，充分混勻后加入吸附柱中,，室溫放置2min，12000rpm離心1min,，倒掉收集管中的廢液,，將吸附柱重新放回收集管中。如果溶液量多可分多次加入,。 
9,、向吸附柱中加入700ul漂洗液(使用前請(qǐng)先檢查是否已加入無(wú)水乙醇),，12000rpm離心1min，棄廢液,，將吸附柱放入收集管中,。 
10、向吸附柱中加入500ul漂洗液,，12000rpm離心1min,，棄廢液，將吸附柱放入收集管中,。 
11,、12000rpm離心2min，將吸附柱敞口置于室溫或50℃溫箱放置數(shù)分鐘,，目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除,，否則漂洗液中的乙醇會(huì)影響后續(xù)的實(shí)驗(yàn)如酶切、PCR等,。 
12,、將吸附柱放入一個(gè)干凈的離心管中，向吸附膜*懸空滴加50-200ul經(jīng)65℃水浴預(yù)熱的洗脫液,，室溫放置2min,，12000rpm離心1min。 
13,、為了增加質(zhì)粒的回收效率，可將得到的洗脫液重新加入吸附柱中,，室溫放置2min,，12000rpm離心1min。 
盒注意事項(xiàng): 
1.  使用前請(qǐng)先檢查溶液 P2,、P3 和結(jié)合液是否出現(xiàn)混濁,，如有混濁現(xiàn)象，可在 37℃水浴中加熱幾分鐘,，待溶液恢復(fù)澄清后再使用,。 
2.  洗脫緩沖液體積不應(yīng)少于 50ul，體積過(guò)小影響回收效率,；洗脫液的 pH值對(duì)洗脫效率也有影晌,，若需要用水做洗脫液應(yīng)保證其 pH值在 8.0 左右(可用 NaOH 將水的 pH值調(diào)至此范圍)， pH值低于 7. 0 會(huì)降低洗脫效率,。DNA產(chǎn)物應(yīng)保存在-20℃,，以防 DNA 降解。 
3.  質(zhì)粒DNA濃度＞1mg/ml時(shí)清除內(nèi)毒素效率降低,。由于質(zhì)粒DNA本身的性質(zhì),，清除過(guò)程可導(dǎo)致部分質(zhì)粒DN丟失,，但內(nèi)毒素卻能得到大限度清除。 
4.  所有溶液應(yīng)用無(wú)內(nèi)毒素的高純水配制,，所有器械材料均應(yīng)不含內(nèi)毒素,，玻璃器皿可高溫烘烤，非揮發(fā)性水溶液可高壓處理,。 
5. DNA濃度及純度檢測(cè)：得到的質(zhì)粒DNA純度與樣品保存時(shí)間,、操作過(guò)程中的剪切力等因素有關(guān)。  得到的DN可用瓊脂糖疑膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢測(cè)濃度與純度,。 DNA應(yīng)在OD260處有顯著吸收峰,，OD260值為 1 相當(dāng)于大約 50μg/ml雙鏈DNA、 40μg/ml單鏈DNA,。OD260/OD280比值應(yīng)為 1.7-1.9,，如果洗脫時(shí)不使用洗脫緩沖液，而使用去離子水,，比值會(huì)偏低,，因?yàn)閜H值和離子存在會(huì)影響吸光值，但并不表示純度低,。  
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