猴促性腺激素釋放激素（GnRH）酶聯(lián)免疫分析
                                                   試劑盒使用說(shuō)明書(shū)
本試劑僅供研究使用 目的：本試劑盒用于測(cè)定猴血清，血漿及相關(guān)液體樣本中促性腺激素釋放激素（GnRH）的含量,。
實(shí)驗(yàn)原理：
本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測(cè)定標(biāo)本中猴促性腺激素釋放激素（GnRH）水平,。用純化的猴促性腺激素釋放激素（GnRH）抗體包被微孔板，制成固相抗體,，往包被單抗的微孔中依次加入促性腺激素釋放激素（GnRH）,，再與HRP 標(biāo)記的羊抗鼠抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物,，經(jīng)過(guò)*洗滌后加底物TMB 顯色,。TMB 在HRP 酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色,。顏色的深淺和樣品中的促性腺激素釋放激素（GnRH）呈正相關(guān),。用酶標(biāo)儀在450nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD 值），通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中猴促性腺激素釋放激素（GnRH）濃度,。

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試劑盒組成：
試劑盒組成48 孔配置96 孔配置保存
說(shuō)明書(shū)1 份1 份
封板膜2 片（48） 2 片（96）
密封袋1 個(gè)1 個(gè)
酶標(biāo)包被板1×48 1×96 2-8℃保存
標(biāo)準(zhǔn)品：45ng/L 0.5ml×1 瓶0.5ml×1 瓶2-8℃保存
標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液1.5ml×1 瓶1.5ml×1 瓶2-8℃保存
酶標(biāo)試劑3 ml×1 瓶6 ml×1 瓶2-8℃保存
樣品稀釋液3 ml×1 瓶6 ml×1 瓶2-8℃保存
顯色劑A 液3 ml×1 瓶6 ml×1 瓶2-8℃保存
顯色劑B 液3 ml×1 瓶6 ml×1 瓶2-8℃保存
終止液3ml×1 瓶6ml×1 瓶2-8℃保存
濃縮洗滌液（20ml×20 倍）×1 瓶（20ml×30 倍）×1 瓶2-8℃保存
樣本處理及要求：
1. 血清：室溫血液自然凝固10-20 分鐘,，離心20 分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分）,。仔細(xì)收集上清，保存過(guò)程中如出現(xiàn)沉淀,，應(yīng)再次離心,。
2. 血漿：應(yīng)根據(jù)標(biāo)本的要求選擇EDTA 或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合10-20 分鐘后,，離心20 分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分）,。仔細(xì)收集上清，保存過(guò)程中如有沉淀形成,，應(yīng)該再次離心,。
3. 尿液：用無(wú)菌管收集,，離心20 分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清,，保存過(guò)程中如有沉淀形成,，應(yīng)再次離心。胸腹水,、腦脊液參照實(shí)行,。
4. 細(xì)胞培養(yǎng)上清：檢測(cè)分泌性的成份時(shí)，用無(wú)菌管收集,。離心20 分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分）,。仔細(xì)收集上清。檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的成份時(shí),，用PB（PH7.2-7.4）稀釋細(xì)胞懸液,，細(xì)胞濃度達(dá)到100 萬(wàn)/ml 左右。通過(guò)反復(fù)凍融,，以使細(xì)胞破壞并放出細(xì)胞內(nèi)成份,。離心20 分
鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清,。保存過(guò)程中如有沉淀形成,，應(yīng)再次離心。
5. 組織標(biāo)本：切割標(biāo)本后,，稱取重量,。加入一定量的PBS，PH7.4,。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆?。?biāo)本融化后仍然保持2-8℃的溫度。加入一定量的PBS（PH7.4）,，用手工或勻漿器將標(biāo)本勻漿充分,。離心20 分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清,。分裝后一份待檢測(cè),，其余冷凍備用。
6. 標(biāo)本采集后盡早進(jìn)行提取,，提取按相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行,，提取后應(yīng)盡快進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。若不能馬上進(jìn)行試驗(yàn),，可將標(biāo)本放于-20℃保存,，但應(yīng)避免反復(fù)凍融.
7. 不能檢測(cè)含NaN3 的樣品，因NaN3 抑制辣根過(guò)氧化物酶的（HRP）活性,。
操作步驟：
1. 標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋與加樣：在酶標(biāo)包被板上設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品孔10 孔,，在*,、第二孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品100μl，然后在*,、第二孔中加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μl,，混勻；然后從*孔,、第二孔中各取100μl 分別加到第三孔和第四孔,，再在第三、第四孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μl,，混勻,；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl 棄掉,，再各取50μl 分別加到第五,、第六孔中，再在第五,、第六孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50ul,，混勻；混勻后從第五,、第六孔中各取50μl 分別加到第七,、第八孔中，再在第七,、第八孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μl,，混勻后從第七、第八孔中分別取50μl 加到第九,、第十孔中,，再在第九第十孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μl，混勻后從第九第十孔中各取50μl 棄掉,。（稀釋后各孔加樣量都為50μl,，濃度分別為30ng/L， 20ng/L ,，10ng/L,，5ng/L，2.5ng/L,。
2. 加樣：分別設(shè)空白孔（空白對(duì)照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑,，其余各步操作相同）、待測(cè)樣品孔,。在酶標(biāo)包被板上待測(cè)樣品孔中先加樣品稀釋液40μl,，然后再加待測(cè)樣品10μl（樣品zui終稀釋度為5 倍）。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部,，盡量不觸及孔壁,，輕輕晃動(dòng)混勻,。
3. 溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30 分鐘。
4. 配液：將30（48T 的20 倍）倍濃縮洗滌液用蒸餾水30（48T 的20 倍）倍稀釋后備用,。
5. 洗滌：小心揭掉封板膜,，棄去液體，甩干,，每孔加滿洗滌液,，靜置30 秒后棄去，如此重復(fù)5 次,，拍干,。
6. 加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑50μl，空白孔除外,。
7. 溫育：操作同3,。
8. 洗滌：操作同5。
9. 顯色：每孔先加入顯色劑A50μl,，再加入顯色劑B50μl,，輕輕震蕩混勻37℃避光顯色15 分鐘.
10. 終止：每孔加終止液50μl，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）,。
11. 測(cè)定：以空白空調(diào)零,，450nm 波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度（OD 值）。測(cè)定應(yīng)在加終止液后15 分鐘以內(nèi)進(jìn)行,。

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