免疫組化染色方法大匯總
免疫組化的方法很多,，新方法層出不窮,，如二步法,，要不斷更新,，與時(shí)俱進(jìn)。雖然這些方法各有其特色,，但總的來(lái)說(shuō),，只要應(yīng)用恰當(dāng)均可獲得較為滿意的結(jié)果。方法 的選擇并不是影響免疫組化結(jié)果的主要因素,。問(wèn)題在于一個(gè)單位應(yīng)常規(guī)地,、固定地使用一種方法，不宜交替使用不同的方法或經(jīng)常更換方法,。一旦選定一種方法,，應(yīng) 務(wù)必使其標(biāo)準(zhǔn)化，力圖使一抗,、二抗,、標(biāo)記試劑和底物的濃度、孵育時(shí)間和濃度,、緩沖液的使用程序化,、規(guī)范化。

一,、SP法免疫組化染色
原理
鏈霉素抗生物素蛋白（SA）是從鏈霉素中分離出的蛋白質(zhì),，穿透組織的能力比ABC、PAP復(fù)合物大,，反應(yīng)速度快,，它含有四個(gè)亞基，每個(gè)亞基都有與生物素 （Biotin）連接的部位,，且二者間有*的親和力,，SA的等電位接近于6.5，近中性,，而卵白素（Avidin）為10,，因此，SA幾乎不與組織中的 內(nèi)源性凝集樣物質(zhì)發(fā)生非特異性結(jié)合,，使用鏈霉素抗生物素蛋白－過(guò)氧化物酶放大系統(tǒng),，即可產(chǎn)生低背景、高放大效果,。S－P采用生物素標(biāo)記的第二抗體與鏈霉素 抗生物素蛋白連接的過(guò)氧化物酶及基質(zhì)素混合液來(lái)測(cè)定細(xì)胞和組織中的抗原,。
基本染色方法
1,、石蠟切片脫蠟至水；
2,、3％H202室溫孵育5～10分鐘,，以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性；
3,、蒸餾水沖洗,，PBS浸泡5分鐘，（如需采用抗原修復(fù),，可在此步后進(jìn)行）,；
4、5～10％正常山羊血清（PBS稀釋）封閉,，室溫孵育10分鐘,。傾去血清，勿洗,，滴加適當(dāng)比例稀釋的一抗或一抗工作液,，37℃孵育1～2小時(shí)或4℃；
5,、PBS沖洗,，5分鐘×3次；
6,、滴加適當(dāng)比例稀釋的生物素標(biāo)記二抗（1％BSA－PBS稀釋）,，37℃孵育10～30分鐘；或滴加第二代生物素標(biāo)記二抗工作液,，37℃或室溫孵育10～30分鐘,；
7、PBS沖洗,，5分鐘×3次,；
8、滴加適當(dāng)比例稀釋的辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素（PBS稀釋）,，37℃孵育10～30分鐘,；或第二代辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，37℃或室溫孵育10～30分鐘,；
9,、PBS沖洗，5分鐘×3次,；
10,、顯色劑顯色（DAB或AEC）；
11、自來(lái)水充分沖洗,，復(fù)染,，封片。
附：冰凍切片免疫組化染色步驟
1,、冰凍切片4～8um,，室溫放置30分鐘后，入4℃丙酮固定10分鐘,，PBS洗,，5分鐘×3次。
2,、用3％過(guò)氧化氫孵育5～10分鐘,，消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性,。
3,、PBS洗，5分鐘×2次,。
4,、下接石蠟切片免疫組化染色操作步驟。

二,、卵白素－生物素－過(guò)氧化物酶復(fù)合物法
原理
本方法是利用卵白素與生物素*的高度親和力這一生物學(xué)特性,，先將生物素與酶結(jié)合，形成生物素化HRP,，以生物素化HRP與卵白素按一定比例混合,，形成一 個(gè)復(fù)合物。具體步驟是：特異性抗體與組織中抗原結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物,。生物素化二抗再與特異性抗體反應(yīng),，然后加入ABC復(fù)合物，形成抗原＋特異性抗體＋ 生物素化二抗＋卵白素＋生物素＋HRP復(fù)合物,。zui后DAB顯色,。
基本染色方法
1、切片常規(guī)脫蠟至水,；
2,、PBS洗5分鐘×2次；
3,、0.3％甲醇－H2O2 30分鐘,，37℃；
4,、PBS洗5分鐘×2次,；
5、正常動(dòng)物血清20分鐘，37℃,；
6,、適當(dāng)稀釋的特異性抗體60分鐘，37℃,；
7,、PBS洗5分鐘×2次；
8,、適當(dāng)稀釋的生物素標(biāo)記二抗,，30分鐘，37℃,；
9,、PBS洗5分鐘×2次；
10,、ABC復(fù)合物30－60分鐘,，37℃；
11,、PBS洗5分鐘×2次,；
12、DAB顯色,，鏡下控制,；
13、蘇木素襯染,、脫水,、透明、中性樹(shù)膠封固,。
附：微波－ABC法具體操作
1,、常規(guī)脫蠟：二甲苯I、II各10分鐘,，*I,、II各10分鐘；
2,、將切片置入裝有PBS液的染色缸中,，微波修復(fù)1分鐘，冷卻置室溫,；
3,、滴加*抗體，微波修復(fù)1分鐘,，孵育20分鐘,，PBS液沖洗3缸×3分鐘,；
4、滴加第二抗體,，微波修復(fù)1分鐘,，孵育10分鐘，PBS液沖洗3缸×3分鐘,；
5,、滴加第三抗體，微波修復(fù)1分鐘,，孵育10分鐘,，PBS液沖洗3缸×3分鐘；
6,、DAB顯色,，（顯微鏡下控制）終止顯色，蒸餾水水沖洗,。
7,、蘇木素襯染，鹽酸酒精分化,，水洗,，封片。

三,、直接法
原理
用酶標(biāo)記的特異性抗體直接與標(biāo)本中的相應(yīng)抗原反應(yīng)結(jié)合，再與酶的底物作用產(chǎn)生有色的產(chǎn)物,，沉積在抗原－抗體反應(yīng)的部位,。
優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)單、步驟少,、省時(shí),、特異性強(qiáng)、非特異染色較輕,；
缺點(diǎn)：敏感性差,。
基本染色方法
1、切片常規(guī)脫蠟至水,，PBS液,，洗5分鐘；
2,、1：20稀釋的正常血清處理切片20分鐘,；
3、滴加適當(dāng)稀釋酶標(biāo)抗體,，放在濕盒中,，37℃,，30～60分鐘；
4,、PBS洗5分鐘×2次,；
5、顯色,，鏡下控制,；
6、蘇木素襯染,、脫水,、透明、中性樹(shù)脂封固,。

四,、間接法
原理
先用未標(biāo)記的特異性抗體（一抗）與標(biāo)本中的相應(yīng)抗原反應(yīng)，再用抗特異性抗體的酶標(biāo)記抗體與結(jié)合在抗原上的一抗反應(yīng),。
優(yōu)點(diǎn)：方法簡(jiǎn)便,、敏感性較直接法高；
缺點(diǎn)：非特異染色較多,。
基本染色方法
1,、與直接法（1）～（2）相同；
2,、滴加適當(dāng)稀釋的特異性抗體,，4℃到第二天，或室溫30～60分鐘,；
3,、PBS洗5分鐘×2次；
4,、滴加酶標(biāo)記抗體,，室溫30分鐘；
5,、后同直接法,。

五、酶橋法
原理
用化學(xué)交聯(lián)法將酶與抗體分子連接,，染色時(shí)在特異性抗體與標(biāo)本中抗原結(jié)合之后,，用橋抗體結(jié)合于其上，再將抗酶抗體結(jié)合于橋抗體上,，zui后把酶結(jié)合在酶抗體上,，經(jīng)過(guò)底物的呈色反應(yīng)而將抗原顯示出來(lái)。
優(yōu)點(diǎn)：提高了方法的敏感性,，非特異染色較輕,；
缺點(diǎn)：抗酶抗體必須是價(jià),、經(jīng)過(guò)高度純化，否則將降低敏感性,。
基本染色方法
1,、組織切片脫蠟至水，PBS洗5分鐘×2次,；
2,、用.。3％H2O2－甲醇在室溫中處理切片5～30分鐘,；
3,、充分水洗后，PBS洗5分鐘×2次,；
4,、1：20稀釋正常血清，室溫30分鐘,；
5,、PBS洗5分鐘×2次；
6,、一抗,，4℃，16～24小時(shí),；
7,、PBS洗5分鐘×2次；
8,、二抗,，室溫30分鐘，PBS洗5分鐘×2次,；
9、滴加抗酶抗體,，室溫30分鐘,，PBS洗5分鐘×2次；
10,、用過(guò)氧化物酶溶液作用30分鐘,，PBS充分洗凈；
11,、在DAB－H2O2液中進(jìn)行顯色5～30分鐘,，鏡下控制；
12,、下同直接法,。

六,、過(guò)氧化物酶－過(guò)氧化物酶復(fù)合物法（PAP法）
原理
PAP法的基本原理與酶橋法相同，只是用酶和抗體制成的免疫復(fù)合物（PAP）代替了酶橋法中的抗酶抗體和隨后結(jié)合的酶,，把兩個(gè)步驟合并為一個(gè)步驟,。
優(yōu)點(diǎn)：敏感性比間接法高20倍；
缺點(diǎn)：理論上PAP是一種復(fù)合物,，因其不是抗HRP抗體,，不能與HRP結(jié)合，不會(huì)造成背景染色,，但在實(shí)際工作中仍存在比較重的非特異性背景染色,。
基本染色方法
1、組織切片脫蠟至水,；
2,、用0.3％H2O2－甲醇在室溫中處理切片5～30分鐘；
3,、充分水洗后,，PBS洗5分鐘×2次；
4,、1：20稀釋正常血清,，室溫30分鐘；
5,、滴加一抗（兔）,，4℃中反應(yīng)13～24小時(shí)；
6,、PBS洗5分鐘×2次,；
7、加羊抗兔IgG,，室溫30分鐘,，PBS洗5分鐘×2次；
8,、加PAP,，室溫30分鐘，PBS洗5分鐘×2次,；
9,、用DAB顯色5～30分鐘；
10,、蘇木素襯染,、脫水、透明,、中性樹(shù)膠封固,。