細胞中的RNA可以分為信使RNA,、轉(zhuǎn)運RNA和核糖體RNA三大類,，不同組織總RNA提取的實質(zhì)就是將細胞裂解，釋放出RNA,，并通過不同方式去除蛋白,，DNA等雜質(zhì)，zui終獲得高純度RNA產(chǎn)物的過程,。

RNA提取流程

1.樣品處理

從各種不同來源樣品（如細菌,、酵母、血液,、動物組織,、植物組織和培養(yǎng)細胞）,或同一來源樣品的不同組織（如植物幼嫩葉片、成熟根,、莖等）中提取高質(zhì)量的RNA,，因細胞結(jié)構(gòu)及所含的成分不同，樣品預(yù)處理的方式也各有差異,。

樣品的要求

使用新鮮的樣品或取樣后立即在低溫（-20℃或-70℃）冷凍保存的樣品,，避免反復(fù)凍融，因為這會導(dǎo)致提取的RNA降解和提取量下降,。

樣品預(yù)處理方式

植物材料-液氮研磨

動物材料-勻漿,、液氮研磨

細菌-溶菌酶破壁

酵母-液氮研磨、玻璃珠處理,、混合酶破壁

2.細胞裂解

異硫氰酸胍/苯酚法（TRIZOL）

這是一種傳統(tǒng)的RNA提取方法,，適用于大部分動植物材料，但對于次生代謝產(chǎn)物較多的植物材料提取RNA效果較差,。異硫氰酸胍能使核蛋白復(fù)合體解離,，并將RNA釋放到溶液中，采用酸性酚-氯仿混合液抽提,，低PH值的酚將使RNA進入水相,，而蛋白質(zhì)和DNA仍留在有機相，從而可以完成RNA的提取工作,。

該法應(yīng)用非常廣泛,，適用于包括動物組織、微生物,、培養(yǎng)細胞等在內(nèi)的各類動物性材料,，同時還適用于次生代謝物較少的植物性材料，如幼苗,、幼葉等,。該法主要應(yīng)用在動物組織和培養(yǎng)細胞的RNA提取中。

胍鹽/β-巰基乙醇法

適用于各種不同動物材料和次生代謝物少的植物材料,。

在這種方法中,，胍鹽使細胞充分裂解,，β-巰基乙醇作為蛋白的變性劑在實驗全程中可以抑制RNaseA的活性,，保護RNA不被降解,。

我公司的“GREEN”系列總RNA 提取試劑盒是基于這種方法開發(fā)的產(chǎn)品，分別適用于各類不同的材料,。此系列產(chǎn)品的具體實驗步驟和適用范圍在實驗技術(shù)手冊中有詳細介紹,，實驗者可根據(jù)自己的需要進行選擇。

其它方法

有些植物材料多糖多酚含量較高,，如植物果實,，番茄的葉子等，有些植物木質(zhì)化程度較高,，如根莖等組織,。針對這類材料本公司推出了一種全新的植物總RNA提取試劑，該試劑特別適合于從富含多糖,、多酚,、淀粉的材料中提取純度高、完整性好的總RNA,，有關(guān)的具體步驟將在分論中詳細介紹,，實驗者可根據(jù)自己的需要進行選擇。

3. RNA純化及獲得

純化要求

RNA樣品中不應(yīng)存在對酶（如逆轉(zhuǎn)錄酶）有抑制作用的有機溶劑和過高濃度的金屬離子,。避免其它生物大分子如蛋白質(zhì),、多糖和脂類分子的污染。排除DNA分子的污染,。

純化方法及沉淀

方法一：有機溶劑抽提法

氯仿抽提

在使用RNA提取試劑進行RNA提取時,，常使用氯仿進行抽提，以去除蔗糖,、蛋白等雜質(zhì),，并促進水相與有機相的分離，從而達到純化RNA的方法,。在本公司的提取RNA的產(chǎn)品中,，與TRIzol同型試劑法及其衍生試劑盒。

沉淀

氯仿抽提RNA后,，一般采用了異丙醇或乙醇來沉淀水相RNA,。加入0.6倍水相體積的異丙醇或與水相等體積的異丙醇，室溫沉淀20-30分鐘,，高速離心,，可獲得RNA沉淀。

洗滌沉淀

加入無RNase的75%乙醇,，將RNA沉淀振蕩懸浮,，使RNA沉淀中的鹽離子被充分溶解,。然后再離心10-30分鐘。再次沉淀RNA,。離心后,，小心倒掉上清（注意不要倒出RNA沉淀），隨后快速離心1-2秒,，將殘留在管壁上的乙醇手機到管底后,，用小槍頭吸凈，超靜臺中風(fēng)干1-2分鐘（注意不要晾得太干,，否則RNA沉淀不易溶解）,。

溶解沉淀

加入適量RNase-free ddH2O溶解RNA沉淀。

方法二：硅基質(zhì)吸附法

隨著實驗方法的改進,，現(xiàn)已發(fā)展出一種采用吸附材料純化核酸的方法,。目前較常見的有：硅基質(zhì)吸附材料、陰離子交換樹脂和磁珠等,。硅基質(zhì)吸附材料因其具有可特異吸附核酸,，使用方便、快捷,、不使用有毒溶劑如苯酚,、氯仿等優(yōu)點，成為核酸純化的,。

本公司生產(chǎn)的總RNA提取試劑盒（ZP403-ZP407）和GREENspin系列總RNA提取試劑盒即采用硅基質(zhì)吸附達到RNA分離純化目的,，通過專一結(jié)合RNA的離心吸附柱和*的緩沖液系統(tǒng)，使樣品在高鹽條件下與硅膠膜特異結(jié)合,，而蛋白,、有機溶劑等雜質(zhì)不能結(jié)合到膜上而被洗脫，鹽類則被含有乙醇的漂洗液洗滌,，zui后用RNase-free ddH2O將RNA從硅膠膜上洗脫下來,。

一些特殊組織的RNA提取

纖維組織

心臟/骨骼肌等纖維組織提取RNA的關(guān)鍵在于*破碎組織。這些組織細胞密度低,，單位重量的組織中RNA含量較低,，建議增加起始量。此外,，一定要在液氮中將組織*磨碎,。

蛋白/脂肪含量較高的組織

腦或植物脂肪含量高，酚/氯仿抽提后,，上清含白色絮狀物,。必須用氯仿再次對上清進行抽提。

核酸/RNase含量高的組織

脾,、胸腺等組織的核酸和RNase含量很高,，在液氮中研磨,，再快速勻漿，能有效滅活RNase,。如加入裂解液后變得粘稠,，酚/氯仿抽提不能有效分層，則加入更多裂解液可以解決此問題,。多次酚/氯仿抽提可以去除更多殘留的DNA,。如果加入乙醇后馬上有白色沉淀形成，表明可能有DNA污染,，可以在核酸溶解后用酸性酚/氯仿再次抽提或者用Dnase1消化，去除DNA污染,。

植物組織和真菌組織

植物組織和真菌組織比動物組織更為復(fù)雜,，一般選擇在液氮條件下對樣品進行研磨，以避免內(nèi)源RNase降解RNA,。如果RNA降解問題不能解決,，大多數(shù)情況下是樣品中含有的雜質(zhì)所致。許多植物和真菌中的內(nèi)含雜質(zhì)和多糖,、多酚等都會殘留,，因為這些雜質(zhì)分子與RNA有一些相似性，可與RNA同時沉淀或者吸附,，因此在植物和真菌組織的提取中,，需要用一些特別的步驟或者特別的試劑來去除多糖多酚等雜質(zhì)的干擾和污染。

RNA評價與鑒定

提取得到RNA溶液后,，我們需要對RNA進行相關(guān)的質(zhì)量檢測,，以確定它是否符合后續(xù)實驗的要求。RNA用于不同的后續(xù)實驗,，對其質(zhì)量要求不盡相同,。cDNA文庫構(gòu)建要求RNA完整且無酶等抑制物殘留；Northern blot實驗對RNA完整性要求較高,，對酶反應(yīng)抑制物殘留要求較低,；RT-PCR實驗對RNA完整性要求不太高，但對酶反應(yīng)抑制物殘留要求嚴格,。因此在進行不同的實驗時應(yīng)選擇不同的方法純化RNA,，以達到*的實驗效果。

RNA得率檢測—分光光度計法

RNA得率有很強的組織特異性,，不同組織RNA的豐度和RNA提取的易難程度共同決定了該種組織的RNA得率,。一般來說，可通過分光光度計測定RNA溶液在260nm處的吸光值來計算RNA的含量,。RNA溶液在260,、320,、230、280nm下的吸光度分別代表了核酸,、溶液渾濁度,、雜質(zhì)濃度和蛋白等有機物的吸收值。用標準樣品測得在波長260nm處,，1ug/mlRNA鈉吸光度0.025（光程為1cm）,，即OD260=1時，樣品中RNA濃度為40ug/ml,。通常分光光度計OD260的讀數(shù)要介于0.15-1.0之間才是可靠的,。因此RNA提取結(jié)束后，要根據(jù)大概產(chǎn)量稀釋到適當濃度范圍,，再用分光光度計檢測,。按下面的共識計算總RNA濃度：

總RNA濃度（ug/ml）=OD260×稀釋倍數(shù)×40ug/ml

RNA純度檢測---分光光度計法

通過OD260/280來檢測RNA純度，OD260/230作為參考值,。

OD260/280在1.9-2.1之間,，可以認為RNA的純度較好；

OD260/280值小于1.8,，則表明蛋白雜質(zhì)較多,；

OD260/280值大于2.2，則表明RNA已經(jīng)降解,；

OD260/230值小于2.0,，則表明裂解液中有異硫氰酸胍和β-巰基乙醇法殘留。

注意：如果用TE溶解或洗脫RNA,，會使OD260/280值偏大,。