一,、CIK細(xì)胞療法

1,、CIK細(xì)胞介紹

    細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷（cytokine-induced killer,，CIK）細(xì)胞,，是將人外周血單個(gè)核細(xì)胞在體外用多種細(xì)胞因子（如抗CD3單克隆抗體,、IL-2和IFN-γ等）共同培養(yǎng)一段時(shí)間后獲得的一 群異質(zhì)細(xì)胞,。由于主要效應(yīng)細(xì)胞同時(shí)表達(dá)CD3和CD56兩種膜蛋白分子,，故又被稱為NK細(xì)胞樣T淋巴細(xì)胞,，兼具有T淋巴細(xì)胞強(qiáng)大的抗瘤活性和NK細(xì)胞的非 MHC限制性殺瘤優(yōu)點(diǎn)。因此,，CIK細(xì)胞被認(rèn)為是新一代抗腫瘤過繼細(xì)胞免疫治療的方案,。

    CIK細(xì)胞中的效應(yīng)細(xì)胞CD3+CD56+細(xì)胞在正常人外周血中極其罕見，僅1%～5%,，在體外經(jīng)多因子培養(yǎng)28～30天,，CD3+CD56+細(xì)胞迅速增多,，較培養(yǎng)前升幅可達(dá)1000倍以上。實(shí)驗(yàn)證明,，擴(kuò)增出的CD3+CD56+細(xì)胞來源于外周血中的CD3+CD56-T細(xì)胞和CD4-CD8+T細(xì)胞,，而非CD3-CD56+NK細(xì)胞。比較CD3+CD56+CIK細(xì)胞中表達(dá)CD8+和CD8-的兩群細(xì)胞其殺瘤活性沒有顯著性差異,，提示CIK細(xì)胞的細(xì)胞毒性與CD3CD56表達(dá)成相關(guān)趨勢(shì),，而與CD8的表達(dá)未表現(xiàn)出相關(guān)性。

2,、CIK細(xì)胞治療殺傷原理

    CIK細(xì)胞能夠通過三種途徑殺滅腫瘤細(xì)胞和病毒感染細(xì)胞： 

    CIK細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞和病毒感染細(xì)胞的直接殺傷：CIK細(xì)胞可以通過不同的機(jī)制識(shí)別腫瘤細(xì)胞,，釋放顆粒酶/穿孔素等毒性顆粒，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞裂解,。 　　

    CIK細(xì)胞釋放的大量炎性細(xì)胞因子具有抑瘤殺瘤活性：體外培養(yǎng)的CIK細(xì)胞可以分泌多種細(xì)胞因子,，如IFN-γ、TNF-α,、IL-2等,，不僅對(duì)腫瘤細(xì)胞有直接抑制作用，還可通過調(diào)節(jié)機(jī)體免疫系統(tǒng)反應(yīng)間接殺傷腫瘤細(xì)胞,。 　　

    CIK細(xì)胞能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡：CIK細(xì)胞在培養(yǎng)過程中表達(dá)FasL（Ⅱ型跨膜糖蛋白）通過與腫瘤細(xì)胞膜表達(dá)的Fas（Ⅰ型跨膜糖蛋白）結(jié)合,，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。

3,、CIK細(xì)胞治療殺瘤特點(diǎn)

1. 增殖速度快 　　

    CIK細(xì)胞在培養(yǎng)過程中加入多種細(xì)胞因子后,，細(xì)胞增殖速度迅速加快，在培養(yǎng)第22天增殖曲線達(dá),，其中CD3+CD56+細(xì)胞不僅數(shù)量增加1000倍以上,，且所占百分比也大幅上升，培養(yǎng)至28～30天時(shí)達(dá)平臺(tái)期,，細(xì)胞毒活性亦達(dá)峰值,。

2. 殺瘤活性高 　　

    CIK細(xì)胞是以CD3+CD56+T細(xì)胞為主的異質(zhì)細(xì)胞群，大量體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)CIK細(xì)胞較以NK細(xì)胞為主的LAK細(xì)胞具備更強(qiáng)大的殺瘤活性,，而且其體內(nèi)殺瘤細(xì)胞毒性的維持不必依賴大劑量外源性IL-2的持續(xù)給予,。體外實(shí)驗(yàn)表明CIK細(xì)胞殺傷效率更高。

3.殺瘤譜廣 　

    CIK細(xì)胞因沒有T 淋巴細(xì)胞殺傷時(shí)的MHC 限制性,，故對(duì)于多種腫瘤細(xì)胞系（包括K562,、Hela、HL60,、OCRF-CEM等）和新鮮腫瘤組織均表現(xiàn)出強(qiáng)大的殺傷活性,。

4. 對(duì)多重耐藥腫瘤細(xì)胞同樣敏感 　

    CIK細(xì)胞對(duì)化療藥物敏感的親本細(xì)胞和不敏感的轉(zhuǎn)化細(xì)胞均具有強(qiáng)大的殺傷活性，兩者比較無差別。

5. 殺瘤活性不受CsA,、FK506等免疫抑制劑的影響 　　

    Mehta觀察到免疫抑制劑CsA和FK506雖然可以抑制抗CD3單抗介導(dǎo)的CIK細(xì)胞脫顆粒過程,，卻不影響靶細(xì)胞誘導(dǎo)的CIK細(xì)胞脫顆粒，并且CIK細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的殺傷活性不會(huì)因此降低　

6. 對(duì)正常骨髓造血前體細(xì)胞毒性很小

    實(shí)驗(yàn)證實(shí)CIK細(xì)胞對(duì)正常髓系克隆生成幾乎沒有影響,。 　　

7. 能抵抗腫瘤細(xì)胞引發(fā)的效應(yīng)細(xì)胞Fas-FasL凋亡

4,、CIK細(xì)胞治療適應(yīng)癥   

    CIK細(xì)胞治療屬于過繼細(xì)胞免疫療法，由于CIK細(xì)胞溶瘤作用是非MHC限制性的,，即不受腫瘤組織類型的限制，因此對(duì)任何一種腫瘤均有殺傷作用,，但對(duì)高抗 原表達(dá)的癌癥療效,，如：髓性白血病、黑色素瘤,、腎細(xì)胞癌,、轉(zhuǎn)移性腎癌、非何杰金氏淋巴瘤等,。其它癌癥如肺癌,、結(jié)腸癌、乳腺癌,、肝癌,、胃癌、大腸癌 等,，CIK細(xì)胞治療亦有較好的療效,。CIK細(xì)胞治療適用于任何一期的癌癥患者，但對(duì)早期腫瘤患者或經(jīng)過手術(shù)及放化療后腫瘤負(fù)荷較小的患者效果好,。它對(duì)于手 術(shù),、放化療或造血干細(xì)胞移植后患者體內(nèi)微小殘留病灶的清除，防止癌細(xì)胞擴(kuò)散和復(fù)發(fā),，提高患者自身免疫力,，減少毒性反應(yīng)等方面具有重要作用。某些不適合手 術(shù),、不能耐受放化療的中晚期腫瘤患者,，CIK細(xì)胞治療可以提高其生活質(zhì)量，延長帶瘤生存時(shí)間,。

5,、CIK細(xì)胞治療有效期

    CIK 細(xì)胞通過直接殺傷、分泌多種細(xì)胞因子等直接抑制腫瘤細(xì)胞生長,，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡等途徑起到治療作用,。大多數(shù)執(zhí)行殺傷功能的細(xì)胞在回輸后立即執(zhí)行其功能，半 衰期約2周至一個(gè)月?；剌?shù)募?xì)胞中包括一部分記憶細(xì)胞，可存活幾年至幾十年,，當(dāng)遇到相應(yīng)刺激后,，迅速在體內(nèi)活化，殺傷靶細(xì)胞,。所以CIK細(xì)胞治療的療程間 隔原則上為一個(gè)月,，建議首先間隔一個(gè)月連續(xù)做三個(gè)療程，以后每半年做一個(gè)療程,。

二,、DC-CIK細(xì)胞療法

1、DC-CIK細(xì)胞介紹

    DC-CIK細(xì)胞是DC細(xì)胞與CIK細(xì)胞共培養(yǎng)而獲得的異質(zhì)性細(xì)胞群體,。樹突狀細(xì)胞(DC)因成熟時(shí)伸出許多樹突樣或偽足樣突起而得名,，它是機(jī)體中功能zui 強(qiáng)的專職抗原遞呈細(xì)胞，能地?cái)z取,、加工處理和遞呈抗原,。成熟的DC可以通過Ⅱ型組織相容性抗原（MHC-Ⅱ）等途徑提呈腫瘤抗原，有效抵制腫瘤細(xì)胞的 免疫逃逸機(jī)制,。此外,，DC細(xì)胞是機(jī)體免疫反應(yīng)的首要環(huán)節(jié)，能夠刺激初始型T細(xì)胞增殖活化,，識(shí)別和殺傷腫瘤細(xì)胞,，并能抑制腫瘤血管生成，同時(shí)激發(fā)免疫記憶保 護(hù),，與腫瘤的發(fā)生,、發(fā)展有著密切關(guān)系，是激活機(jī)體免疫系統(tǒng),、激發(fā)抵御癌癥侵襲zui有效的途徑之一,。

    在腫瘤免疫中，DC不能直接殺傷腫瘤細(xì)胞,，但能通過識(shí)別腫瘤細(xì)胞特異性抗原,，將其信號(hào)呈遞給具殺傷效應(yīng)的T細(xì)胞來達(dá)到監(jiān)測(cè)、殺滅腫瘤的功能,，因此常與腫瘤殺傷細(xì)胞CIK細(xì)胞聯(lián)合使用

2,、DC-CIK細(xì)胞治療原理

    1. DC細(xì)胞治療腫瘤的原理

    1.1 DC可以高表達(dá)MHC-Ⅰ類和MHC-Ⅱ類分子，MHC分子與其捕獲加工的腫瘤抗原結(jié)合,，形成肽-MHC分子復(fù)合物,，并遞呈給T細(xì)胞,，從而啟動(dòng)MHC-I類限制性CTL反應(yīng)和MHC-Ⅱ類限制性的CD4+ Thl反應(yīng)。同時(shí),，DC還通過其高表達(dá)的共刺激分子(CD80/B7-1,、CD86/B7-2、CD40等)提供T細(xì)胞活化所必須的第二信號(hào),，啟動(dòng)了免疫應(yīng)答,。

    1.2 DC與T細(xì)胞結(jié)合可大量分泌IL-12、IL-18,，激活T細(xì)胞增殖,，誘導(dǎo)CTL生成，主導(dǎo)Th1型免疫應(yīng)答,，利于腫瘤清除,；激活穿孔素P、顆粒酶B和FasL/Fas介導(dǎo)的途徑增強(qiáng)NK細(xì)胞毒作用,。

    1.3 DC分泌趨化因子(Chemotactic Cytokines,，CCK)專一趨化初始型T細(xì)胞,，促進(jìn)T細(xì)胞聚集,，增強(qiáng)了T細(xì)胞的激活。保持效應(yīng)T細(xì)胞在腫瘤部位長期存在,，可能通過釋放某些抗血管生 成物質(zhì)(如IL-12,、IFN-γ)及前血管生成因子而影響腫瘤血管的形成。上述CCK進(jìn)一步以正反饋旁分泌的方式活化DC,，上調(diào)IL-12及CD80,、CD86的表達(dá)；同時(shí)DC 也直接向CD8+T細(xì)胞呈遞抗原肽,，在活化的CD4+ T細(xì)胞輔助下使CD8+ T細(xì)胞活化,，CD4+ 和CD8+T細(xì)胞還可以進(jìn)一步通過分泌細(xì)胞因子或直接殺傷，增強(qiáng)機(jī)體抗腫瘤免疫應(yīng)答,。

    2. CIK細(xì)胞治療腫瘤的原理

    2.1 CIK細(xì)胞能以不同的機(jī)制識(shí)別腫瘤細(xì)胞,，通過直接的細(xì)胞質(zhì)顆粒穿透封閉的腫瘤細(xì)胞膜進(jìn)行胞吞。實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞的裂解,；

    2.2 通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡殺傷腫瘤細(xì)胞,；

    2.3 CIK細(xì)胞分泌IL-2、IL-6,、IFN-γ等多種抗腫瘤的細(xì)胞因子,；

    2.4 CIK細(xì)胞回輸后可以激活機(jī)體免疫系統(tǒng)，提高機(jī)體的免疫功能,。

    將CIK細(xì)胞和同源DC細(xì)胞共培養(yǎng)后即可獲得DC-CIK細(xì)胞,。它既可促進(jìn)DC細(xì)胞的成熟,，更能促進(jìn)ClK的增殖，并加強(qiáng)其抗腫瘤活性,。DC細(xì)胞是機(jī)體免 疫應(yīng)答的始動(dòng)者,，能夠誘導(dǎo)持久有力的特異性抗腫瘤免疫反應(yīng)，CIK細(xì)胞可通過非特異性免疫殺傷作用清除腫瘤患者體內(nèi)微小殘余病灶,，所以負(fù)載腫瘤抗原的DC 與CIK的有機(jī)結(jié)合（即DC-CIK細(xì)胞）能產(chǎn)生特異性和非特異性的雙重抗腫瘤效應(yīng),。

3、DC-CIK細(xì)胞治療方法

    1,、治療流程：

    確定患者的入選標(biāo)準(zhǔn)→相關(guān)檢查→血液采集→分離外周血單個(gè)核細(xì)胞→分別培養(yǎng)DC細(xì)胞和CIK細(xì)胞→DC細(xì)胞和CIK細(xì)胞共同培養(yǎng)→獲得DC-CIK細(xì)胞→細(xì)胞回輸→療效評(píng)估→隨訪

    2,、培養(yǎng)方法

    2.1 治療前檢查血常規(guī)、凝血功能等常規(guī)項(xiàng)目,；

    2.2 用血液分離機(jī)采集病人外周血淋巴細(xì)胞或直接采集外周血,；

    2.3 在GMP實(shí)驗(yàn)室里，從采集的外周血中分離出單個(gè)核細(xì)胞,，經(jīng)多種細(xì)胞因子誘導(dǎo),、激活后進(jìn)行增殖培養(yǎng)，此過程需要9-12天,；

    2.4 于培養(yǎng)的第9-13天開始分次回輸CIK細(xì)胞和DC細(xì)胞,，每次回輸過程大概1.5個(gè)小時(shí)；

    2.5 一個(gè)療程約14-16天,。此后視情況進(jìn)行下一療程治療,。

4、DC-CIK細(xì)胞治療特點(diǎn)

    1,、細(xì)胞毒活性及增殖能力強(qiáng),，細(xì)胞因子分泌量大，療效顯著,；

    2,、特異性強(qiáng)，只對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行有效識(shí)別和殺滅,，而不傷害正常組織和細(xì)胞,；

    3、抗瘤譜廣,，對(duì)體內(nèi)各種腫瘤細(xì)胞均能有效治療,；

    4、安全性好,，無毒副作用,，除可能出現(xiàn)的發(fā)熱、少量出血外,，無其他不良反應(yīng),。

    5,、減少惡性腫瘤術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，可顯著增強(qiáng)腫瘤患者免疫系統(tǒng)功能,，有利于清除術(shù)后體內(nèi)殘留的癌細(xì)胞（及微轉(zhuǎn)移灶）,，降低局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移發(fā)生。

5,、DC-CIK細(xì)胞治療療效

    CIK細(xì)胞和DC細(xì)胞是細(xì)胞免疫治療的2個(gè)重要組成部分,，DC細(xì)胞就像“雷達(dá)”，能識(shí)別抗原,，激活免疫應(yīng)答,。CIK細(xì)胞就像“導(dǎo)彈”，能通過發(fā)揮自身細(xì)胞 毒性,，分泌細(xì)胞因子,，殺傷腫瘤細(xì)胞。“雷達(dá)+導(dǎo)彈”產(chǎn)生了一個(gè)和諧的免疫體系,，兩者聯(lián)合能夠修復(fù)受損的免疫系統(tǒng),，激活機(jī)體的免疫細(xì)胞，有效清除手 術(shù),、放療,、化療后殘余的癌細(xì)胞，預(yù)防復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移,，可增強(qiáng)放療,、化療的敏感性,，減少放,、化療的毒副作用，增強(qiáng)患者對(duì)放,、化療的耐受性,，明顯改善患者的生活質(zhì) 量，有效延長生存期,。

6,、DC-CIK細(xì)胞治療實(shí)用范圍

    由于DC-CIK細(xì)胞發(fā)揮識(shí)別和殺傷腫瘤細(xì)胞的功能不受MHC等因素限制，因此具有廣譜抗腫瘤作用,，臨床可應(yīng)用于多種癌癥不同階段的治療（Ｔ細(xì)胞淋巴癌/瘤除外）,。

1、呼吸系統(tǒng)：肺癌（小細(xì)胞肺癌,、鱗癌,、腺癌）等

2、消化系統(tǒng)：肝癌,、胃癌,、腸癌等

3,、泌尿系統(tǒng)：腎癌、腎上腺癌及其轉(zhuǎn)移癌等

4,、血液系統(tǒng)：急慢性白血病,、淋巴瘤（除T細(xì)胞淋巴瘤）及其轉(zhuǎn)移癌等

5、其他腫瘤：惡性黑色素瘤,、鼻咽瘤,、乳腺癌、宮頸癌,、前列腺癌,、舌癌、甲狀腺癌等所有實(shí)體腫瘤,，還包括腫瘤轉(zhuǎn)移,，以及惡性胸水、惡性腹水等,。

三,、NK細(xì)胞療法

1、NK細(xì)胞簡(jiǎn)介

    自然殺傷細(xì)胞（NK cell, Natural killer cell）是一種細(xì)胞質(zhì)中具有大顆粒的細(xì) 胞,，也稱NK細(xì)胞,，由骨髓細(xì)胞發(fā)育而成。因?yàn)槠浞菍Ｒ恍缘募?xì)胞毒殺作用而被命名,。NK細(xì)胞主要分布于外周血中,，占外周血單核細(xì)胞（PBMC）的 5%～10%，淋巴結(jié)和骨髓中也存在NK細(xì)胞,，水平較外周血低,，但它可以消滅許多種病源體及多種腫瘤細(xì)胞。自然殺傷細(xì)胞會(huì)直接和陌生細(xì)胞接觸,，并以細(xì)胞膜 破裂之方式殺死此細(xì)胞,，可利用分泌穿孔素及腫瘤壞死因子，摧毀目標(biāo)細(xì)胞,。目前研究認(rèn)為NK 細(xì)胞特異性表達(dá)CD56,，而缺乏T 細(xì)胞抗原CD3。一般認(rèn)為在PBMC中分選到CD3- / CD56+的細(xì)胞即為NK細(xì)胞,。

    NK細(xì)胞屬于粒狀淋巴細(xì)胞,，是先天性免疫系統(tǒng)的重要組成部分，也是機(jī)體抗御感染和防止細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的重要免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞,。它對(duì)靶細(xì)胞殺傷時(shí)既不需特異性抗體參加,，也不需抗原預(yù)先致敏。卻能立即發(fā)揮非特異性殺傷靶細(xì)胞的作用,，尤其是對(duì)多種腫瘤細(xì)胞有迅速殺傷和溶解作用,。因此,，NK細(xì)胞對(duì)癌癥的監(jiān)視作用和抵抗功能已越來越受到重視。

2,、NK細(xì)胞的活化

    NK細(xì)胞可通過多種途徑被活化,，包括細(xì)胞膜表面的CD2、CD3分子和多種細(xì)胞因子,。

    1. 通過CD3分子的ζ鏈

    NK細(xì)胞不表達(dá)TCR/CD3復(fù)合物,，但部分NK細(xì)胞表達(dá)CD3ζ鏈，當(dāng)用CD16抗體刺激NK細(xì)胞活化時(shí),，ζ鏈發(fā)生酪氨酸磷酸化,，引起胞漿內(nèi)Ca2+ 濃度升高，IP3水平增加,，促進(jìn)細(xì)胞因子合成和ADCC作用,。

    2. 通過CD2分子

    CD2與CD58相互作用或用CD2 McAb刺激可活化NK細(xì)胞，CD3 ζ鏈發(fā)生酪氨酸磷酸化,。

    3. 自然殺傷細(xì)胞刺激因子

    自然殺傷細(xì)胞刺激因子（natural killer cell stimulatory factor, NKSF) 對(duì)NK細(xì)胞有刺激作用,。

IL-2、IL-12,、IFN-α,、TNF-α以及白細(xì)胞調(diào)節(jié)素(leukoregulin, LR) 對(duì)NK細(xì)胞的活化和分化有正調(diào)節(jié)作用， 體外培養(yǎng)時(shí)加入上述細(xì)胞因子可明顯提高NK的殺傷活性,。

    3,、NK細(xì)胞的功能

    1. 自然殺傷活性，NK細(xì)胞的殺傷活性無MHC限制,，不依賴抗體,，可以直接通過分泌釋放穿孔素、顆粒酶,、NK細(xì)胞毒性因子,、TNF-α和TNF-β等對(duì)病毒感染的細(xì)胞,、白血病細(xì)胞以及其他腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒活性,，從而殺傷或者裂解靶細(xì)胞；

    2. 抗病毒感染,，NK可選擇性地殺傷病毒感染的靶細(xì)胞,。由輔佐細(xì)胞或NK細(xì)胞所產(chǎn)生的IFN可協(xié)同NK的抗病毒作用，而對(duì)正常細(xì)胞有保護(hù)作用,。另一方面,，病毒 感染細(xì)胞表面的病毒抗原和其它表面分子使得其對(duì)NK細(xì)胞的殺傷作用變得更加敏感。此外,，NK細(xì)胞在體外還可殺傷某些細(xì)菌,、真菌,、原蟲等，可能與NK細(xì)胞釋 放某些殺傷介質(zhì)有關(guān),。

    3. NK細(xì)胞在免疫監(jiān)視,、殺傷突變的腫瘤細(xì)胞可能比T細(xì)胞具有更重要的作用。某些疾病如Chediak-Higashi或X性聯(lián)淋巴增殖綜合征患者,， 由于NK功能缺陷對(duì)惡性淋巴細(xì)胞增殖疾病特別易感,。

    4. 參與骨髓移植后移植物抗白血病效應(yīng)：在體外NK細(xì)胞可殺傷某些淋巴樣和髓樣白血病細(xì)胞。骨髓移植后數(shù)周內(nèi),，來自供體的NK細(xì)胞在PBL中占相當(dāng)高的比例,。此外，在體內(nèi)NK細(xì)胞還可殺傷某些不成熟細(xì)胞如骨髓干細(xì)胞,、胸腺細(xì)胞亞群等,。 (graft-versus-leukemia effect,GVL)

4、NK細(xì)胞抗腫瘤機(jī)理

    NK細(xì)胞的抗腫瘤作用機(jī)理復(fù)雜,，可能通過不同的機(jī)制殺傷瘤細(xì)胞：

    1.由穿孔素,、顆粒酶介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞壞死；

    2. NK細(xì)胞直接與腫瘤細(xì)胞接觸,，由NK細(xì)胞表面的膜型TNF介導(dǎo)瘤細(xì)胞的凋亡或NK細(xì)胞釋放的分泌型TNF間接介導(dǎo)瘤細(xì)胞的凋亡,；

    3. NK細(xì)胞破壞或活化腫瘤微血管系統(tǒng)，導(dǎo)致其他效應(yīng)細(xì)胞和細(xì)胞毒分子滲出到腫瘤組織,，引起腫瘤的出血壞死,。

5、NK細(xì)胞治療方法

    1,、治療流程：

    確定患者的入選標(biāo)準(zhǔn)→相關(guān)檢查→血液采集→分離外周血單個(gè)核細(xì)胞→培養(yǎng)NK細(xì)胞→獲得NK細(xì)胞→細(xì)胞回輸→療效評(píng)估→隨訪

    2,、培養(yǎng)方法：

    1、治療前檢查血常規(guī),、凝血功能等常規(guī)項(xiàng)目,；

    2、用血液分離機(jī)采集病人外周血淋巴細(xì)胞或直接采集外周血,；

    3,、在GMP實(shí)驗(yàn)室里，從采集的外周血中分離出單個(gè)核細(xì)胞,，經(jīng)多種細(xì)胞因子誘導(dǎo),、激活后進(jìn)行增殖培養(yǎng)，此過程需要9-12天,。

    4,、于培養(yǎng)的第9-13天開始分次回輸NK細(xì)胞，每次回輸過程大概1.5個(gè)小時(shí)。

    5,、一個(gè)療程約14-16天,。此后視情況進(jìn)行下一療程治療。

6,、NK細(xì)胞治療特點(diǎn)

    1,、可直接識(shí)別、殺死癌細(xì)胞,，抑制腫瘤的生長及擴(kuò)散,；

    2、可直接改善和調(diào)節(jié)患者的免疫力和神經(jīng)系統(tǒng),；

    3,、通過其分泌的因子抑制腫瘤附近新血管的增生，限制腫瘤生長,；

    4,、分泌多種細(xì)胞因子，減少患者疼痛,，提高生活品質(zhì),；

    5、NK細(xì)胞療法可用于多種癌癥,，尤其對(duì)血液腫瘤,，肺癌、淋巴癌,、食道癌,、乳癌、肝癌等血流旺盛且血管較密集的腫瘤有很好的療效,。

四,、多細(xì)胞療法

1、多細(xì)胞治療簡(jiǎn)介

    多細(xì)胞治療是在原先DC-CIK細(xì)胞免疫治療基礎(chǔ)上增加三種細(xì)胞,，它們分別為NK細(xì)胞,、γδT細(xì)胞、CD3AK細(xì)胞,，通過5種細(xì)胞聯(lián)合治療,，相互協(xié)作，互 通有無,，zui終將癌細(xì)胞殺傷,，控制住病情，成為癌癥治療zui為有效的技術(shù)手段,。有效抑制腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)的治療技術(shù),。

    DC細(xì)胞,，尋找腫瘤細(xì)胞的“雷達(dá)”，能識(shí)別抗原,，激活免疫應(yīng)答,；CIK細(xì)胞就像“導(dǎo)彈”，通過發(fā)揮自身細(xì)胞毒性分泌細(xì)胞因子,，殺傷腫瘤細(xì)胞,；NK細(xì)胞 可以殺傷腫瘤干細(xì)胞，而腫瘤干細(xì)胞是造成腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的元兇,；γδT細(xì)胞具有腫瘤干細(xì)胞殺傷能力和輔助DC疫苗腫瘤識(shí)別能力,；CD3AK細(xì)胞是一種新型 抗腫瘤免疫活性細(xì)胞，能在廣譜殺瘤的基礎(chǔ)上,，有效抑制腫瘤生長,，達(dá)到抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的作用。多細(xì)胞治療中這5種細(xì)胞彼此間相互協(xié)作,，互通有無,，具有更強(qiáng)的靶 向性和更高的殺傷腫瘤活性。

2,、多細(xì)胞免疫治療原理

    多細(xì)胞治療原理和DC-CIK細(xì)胞一樣,，都是通過采集患者外周血分離單個(gè)核細(xì)胞，在GMP實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行細(xì)胞分離,，誘導(dǎo),，擴(kuò)增，激活等方式培養(yǎng)出高品質(zhì)的細(xì)胞,，然后將這些細(xì)胞分多次回輸?shù)交颊唧w內(nèi),。

    多細(xì)胞治療主要是通過DC細(xì)胞、CIK細(xì)胞,、NK細(xì)胞,、γδT細(xì)胞和CD3AK細(xì)胞，這種細(xì)胞被上稱為zui經(jīng)典組合細(xì)胞,，治療癌癥效果非常明顯,。

    具體分工為：DC細(xì)胞入人體調(diào)動(dòng)機(jī)體免疫系統(tǒng)，對(duì)腫瘤抗原進(jìn)行標(biāo)記,，然后指揮免疫細(xì)胞群CIK細(xì)胞,、NK細(xì)胞、γδT細(xì)胞和CD3AK細(xì)胞進(jìn)行殺 傷,；CIK細(xì)胞具有廣譜的殺傷癌細(xì)胞功能,，對(duì)標(biāo)記的癌細(xì)胞進(jìn)行廣泛殺傷；NK細(xì)胞可以有效殺傷腫瘤干細(xì)胞，同時(shí)也具有殺傷成熟癌細(xì)胞功能,；γδT細(xì)胞在殺 傷癌細(xì)胞的同時(shí)又與DC細(xì)胞互為補(bǔ)充,，對(duì)DC無法識(shí)別的癌細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記殺傷；CD3AK細(xì)胞針對(duì)病毒癌細(xì)胞具有*殺傷力,。

3,、 多細(xì)胞治療的特點(diǎn)

    1. 多細(xì)胞治療對(duì)腫瘤殺傷力更強(qiáng)，靶向性更強(qiáng),；

    2. *自體細(xì)胞,，*和排斥反應(yīng)；

    3. 從源頭上治療腫瘤,，*清除癌細(xì)胞,，zui大限度地防止復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移；

    4. 治療效果與患者生活質(zhì)量并重,，保障顯著療效的同時(shí)大大提高患者生活質(zhì)量,。

4、多細(xì)胞免疫治療種類及功能

    DC細(xì)胞,，即樹突狀細(xì)胞,， 它是目前所知人體內(nèi)功能zui強(qiáng)的抗原提呈細(xì)胞，因其成熟的時(shí)候,，伸出許多樹突或偽足樣突起而得名,。DC細(xì)胞能參與腫瘤抗原的識(shí)別、加工處理與提呈,，刺激初始 型T細(xì)胞增殖活化,，識(shí)別和殺傷腫瘤細(xì)胞，并能抑制腫瘤血管生成,，同時(shí)激發(fā)免疫記憶保護(hù),。當(dāng)負(fù)載有腫瘤抗原信息的DC細(xì)胞輸入人體后，將腫瘤信息傳遞給抗腫 瘤細(xì)胞,，使其具有識(shí)別能力,，充分調(diào)動(dòng)，有效殺滅腫瘤細(xì)胞,。

    CIK細(xì)胞,，即細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞，在體外經(jīng)多種細(xì)胞因子共同誘導(dǎo),、培養(yǎng)而成的一類擁有高細(xì)胞毒性的細(xì)胞,，具有T淋巴細(xì)胞強(qiáng)大的抗瘤活性和非MHC限 制性殺瘤特點(diǎn)，殺傷腫瘤細(xì)胞,，殺傷活性可達(dá)84.7%,，同時(shí)有效抑制腫瘤生長,，不損傷任何正常組織細(xì)胞，其效應(yīng)細(xì)胞增殖能力強(qiáng),，毒副作用小,。CIK細(xì) 胞的抗腫瘤價(jià)值主要在于殺瘤活性強(qiáng),、廣譜殺瘤,。常用于治療各種腫瘤，對(duì)低表達(dá)MHC-I,、II類分子的腫瘤效果更好,。

    NK細(xì)胞，即自然殺傷細(xì)胞,，是人體先天免疫的核心組成部分,，是腫瘤細(xì)胞免疫的基礎(chǔ)。NK細(xì)胞是人體內(nèi)抗癌活性zui強(qiáng)的細(xì)胞,，可直接殺死癌細(xì)胞,，抑制腫瘤的生 長及擴(kuò)散；循環(huán)的NK細(xì)胞一旦激活,，它們會(huì)滲透到大多數(shù)組織中攻擊腫瘤細(xì)胞,。它是人體免疫系統(tǒng)的*道防線，與機(jī)體的抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)功能密切相關(guān),。NK 細(xì)胞可用于治療各種腫瘤,，廣泛識(shí)別腫瘤細(xì)胞，分泌穿孔素及腫瘤壞死因子,，迅速溶解,、殺傷、摧毀腫瘤細(xì)胞,，其自然殺傷活性無MHC限制（無免疫應(yīng)答,、移植排 斥限制），起效快,、殺傷能力強(qiáng),，對(duì)于引起腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的腫瘤干細(xì)胞（突變腫瘤細(xì)胞）擁有專一性的細(xì)胞毒殺作用,，同時(shí)在機(jī)體免疫監(jiān)視機(jī)制中起到比單一T細(xì) 胞更重要的作用,，在低表達(dá)MHC-Ⅰ、Ⅱ類分子的腫瘤和惡性血液疾病治療方面效果更好,，其zui顯著的抗腫瘤價(jià)值在于NK細(xì)胞可以殺傷腫瘤干細(xì)胞,，而腫瘤干細(xì) 胞是造成腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的元兇。

    γδT細(xì)胞是介于特異性免疫與非特異性免疫之間的一種特殊類型的免疫細(xì)胞,，其主要分布于 皮膚和黏膜組織,，在腫瘤免疫治療中起著 非常重要的作用,。γδT細(xì)胞在抗腫瘤免疫早期, 即可提供IFN-γ因子抑制腫瘤生長，發(fā)揮專職性抗原遞呈細(xì)胞的作用,，同時(shí)兼具有DC疫苗及NK等細(xì)胞的功能特點(diǎn),，有較強(qiáng)的特異性（DC疫苗補(bǔ)充）和非特 異性腫瘤殺傷能力（識(shí)別、殺傷腫瘤干細(xì)胞,，靶向性強(qiáng)）,，尤其對(duì)于粘膜相關(guān)性腫瘤（如消化系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng),、生殖系統(tǒng)等腫瘤）和惡性血液疾?。ㄈ缍喟l(fā)性骨髓 瘤、粒細(xì)胞性白血病,、淋巴細(xì)胞型白血病等）效果更好,。

    CD3AK細(xì)胞是由抗CD3單克隆抗體和IL-2共同激活誘導(dǎo)的腫瘤殺傷細(xì)胞，通過分泌可溶性細(xì)胞因子參與對(duì)腫瘤直接或間接的殺傷,，具有強(qiáng)體外增殖能力,、 細(xì)胞毒活性，顯著殺傷腫瘤細(xì)胞,，并在廣譜殺瘤的基礎(chǔ)上,，有效抑制腫瘤生長，達(dá)到抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的作用,。CD3AK細(xì)胞用于治療各種腫瘤,，尤其對(duì)于病毒相 關(guān)性腫瘤（如宮頸癌、肝癌,、鼻咽癌,、B細(xì)胞淋巴瘤等）效果更好。

5,、多細(xì)胞免疫治療療效

    多細(xì)胞生物免疫治療目前是世界上治療腫瘤的技術(shù),，是繼手術(shù)、放療及化療后腫瘤治療的第四種模式,。生物免疫治療主要是調(diào)動(dòng)人 體的天然抗癌能力,，恢復(fù)機(jī)體內(nèi)環(huán)境的平衡，可以殺死手術(shù)后殘余癌細(xì)胞,，提升放化療治療效果,，提高患者機(jī)體免疫能力，更好的防轉(zhuǎn)移,，防復(fù)發(fā),。對(duì)放化療起 到減毒增效的作用，有利于放化療的順利進(jìn)行,。生物治療效果明顯,、無毒副作用,、安全性及耐受性好等優(yōu)點(diǎn) ，被稱之為腫瘤治療的“綠色療法”,。對(duì)于不能耐受手術(shù)或放化療的癌癥患者,，該療法可以反復(fù)殺傷腫瘤細(xì)胞，增強(qiáng)患者免疫功能,，提高臨床療效 ,，延長生存期，提高生命質(zhì)量,，大大減輕了治療給腫瘤患者帶來的痛苦,。

6,、多細(xì)胞免疫治療的適應(yīng)癥

    多細(xì)胞生物免疫治療法適用于多種實(shí)體腫瘤,，包括惡性黑色素瘤、前列腺癌,、腎癌,、膀胱癌、卵巢癌,、結(jié)腸癌,、直腸癌、乳腺癌,、宮 頸癌,、肺癌、喉癌,、鼻咽癌,、胰腺癌、肝癌,、胃癌等實(shí)體瘤手術(shù)后防止復(fù)發(fā),，也可以用于多發(fā)性骨髓瘤、B淋巴瘤和白血病等血液系統(tǒng)惡性腫瘤的復(fù)發(fā),，對(duì)于大多數(shù) 細(xì)胞免疫治療的適應(yīng)人群還可以用于上述腫瘤的進(jìn)一步鞏固治療,，達(dá)到延長生存期、提高生活質(zhì)量和抑制腫瘤惡化的目的,。但不適用于T細(xì)胞淋巴瘤患者,、器官移植 后長期使用免疫抑制藥物和正在使用免疫抑制藥物的自身免疫病的患者。