牛偽狂犬病毒（PRV）定性檢測試劑盒（ELISA）

使用說明書

【試劑盒名稱】

牛偽狂犬病毒（PRV）定性檢測試劑盒（ELISA）

【試劑盒用途】

定性檢測牛血清、血漿及相關(guān)液體樣本中偽狂犬病毒（PRV）,。

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【檢測原理】

本試劑盒采用雙抗體一步夾心酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）,。將陰性對照,、陽性對照、待測樣本和酶標(biāo)工作液加入到預(yù)先包被牛偽狂犬病毒（PRV）抗體的透明酶標(biāo)包被板中,，溫育足夠時間后,，洗滌除去未結(jié)合的成分。依次加入顯色劑A,、B液,，顯色劑（TMB）在辣根過氧化物酶（HRP）催化下轉(zhuǎn)化為藍(lán)色產(chǎn)物，在酸的作用下變成黃色,，顏色的深淺與樣品中牛偽狂犬病毒（PRV）濃度呈正相關(guān),，450nm波長下測定OD值，根據(jù)陰性對照,、陽性對照和樣品的OD值,，判斷樣本中是否含有牛偽狂犬病毒（PRV）。

【試劑盒組成】

【需要而未提供的試劑和器材】

1,、37℃恒溫箱

1. 標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格酶標(biāo)儀
2. 精密移液器及一次性吸頭
3. 蒸餾水
4. 一次性試管
5. 吸水紙

【操作步驟】

1,、準(zhǔn)備：從冰箱取出試劑盒，室溫復(fù)溫平衡30分鐘,。

2,、配液：用蒸餾水將20倍濃縮洗滌液稀釋成原倍的洗滌液。

3,、加對照品和待測樣本：取足夠數(shù)量的酶標(biāo)包被板,，固定于框架上，分別設(shè)置陽性對照孔,、陰性對照孔,、待測樣本孔和空白對照孔，記錄各孔位置,，在對照品孔中加入陽性對照品和陰性對照品各50μL,；待測樣本孔中先加入待測樣本10μL，再加樣本稀釋液40μL（即樣本稀釋5倍）；每孔再加入酶標(biāo)工作液100μL,；空白對照孔不加,。

4、溫育：37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min,。

5,、洗板：棄去液體，吸水紙上拍干,，每孔加滿洗滌液,，靜置1min，甩去洗滌液,，吸水紙上拍干,，如此重復(fù)洗板5次（也可用洗板機按說明書操作洗板）。

6,、顯色：每孔先加入顯色劑A 液50μL,，再加入顯色劑B液 50μL，37℃避光顯色15min,。

7,、終止：取出酶標(biāo)板，每孔加終止液50μL,，終止反應(yīng)（顏色由藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）,。

8、測定：以空白孔調(diào)零,，在終止后15分鐘內(nèi),，用450nm波長測量各孔的吸光值（OD值）。

【樣本要求】

1,、樣本不能含疊氮鈉（NaN₃）,，因為疊氮鈉（NaN₃）是辣根過氧化物酶（HRP）的抑制劑。

2,、標(biāo)本采集后盡早進行提取,，提取按相關(guān)文獻進行，提取后應(yīng)盡快進行實驗,。若不能立即試驗,，可將標(biāo)本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融,。

3,、樣本應(yīng)充分離心，不得有溶血及顆粒,。

【注意事項】

1、實驗嚴(yán)格按照說明書的操作進行，實驗結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn),。

2,、酶標(biāo)包被板開封后如未用完，應(yīng)立即裝入密封袋中加干燥劑保存,。

3,、建議所有的標(biāo)準(zhǔn)品、樣本和空白對照都做雙份檢測,，取平均值,，以減小實驗誤差。

4,、若顯色過淺,，可適當(dāng)延長底物溫育時間。

5,、為避免交叉污染,，標(biāo)準(zhǔn)品、樣本和空白對照每加一個就要更換一次吸頭,；酶標(biāo)工作液,、樣本稀釋液和底物等公共組分，要懸臂加樣,，不得碰到微孔,；不得重復(fù)使用封板膜。

6,、試劑盒保質(zhì)期內(nèi)使用,，不同批號的試劑不得混用。

7,、底物B對光敏感,，避免長時間暴露于光下。

【結(jié)果判斷】

1 試驗有效性：陽性對照孔OD值平均值≥1.00,；

                陰性對照孔OD值平均值≤0.15,。

2 臨界值（Cut off）計算：臨界值=陰性對照孔平均值+0.15

3 陰性判斷：樣品OD值＜臨界值（Cut off），樣品為陰性

4 陽性判斷：樣品OD值＞臨界值（Cut off）,，樣品為陽性

【操作程序總結(jié)】

準(zhǔn)備試劑,，樣品和對照品

加入準(zhǔn)備好的樣品、對照品品和酶標(biāo)工作液,，37℃反應(yīng)60分鐘

洗板5次,，加入顯色液A、B,，37℃顯色15分鐘

加入終止液

15分鐘之內(nèi)讀OD值

計算

【規(guī)格】

96人份/盒

【貯藏】

2-8℃,，避光防潮保存。

【有效期】

6個月

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