儲存條件：
細(xì)胞裂解液R 4℃放置；溶菌酶（100ug/ul） -20℃保存,；其他試劑室溫保存,。另外，為了去除RNA 中少量殘存的DNA,，客戶可根據(jù)需要購買DNase I,。
產(chǎn)品簡介
本試劑盒可從細(xì)菌細(xì)胞中快速提取總RNA，可同時處理大量不同樣品,。提取的總RNA 純度高,，沒有蛋白和其它雜質(zhì)的污染，可用于RT-PCR,、Real Time RT-PCR,、芯片分析、Northern blot,、Dot blot,、polyA 篩選、體外翻譯,、RNase 保護(hù)分析和分子克隆等多種下游實(shí)驗(yàn),。預(yù)防RNase污染，應(yīng)注意以下幾方面：
1. 經(jīng)常更換新手套,。因?yàn)槠つw經(jīng)常帶有細(xì)菌,，可能導(dǎo)致RNase 污染。
2. 使用無RNase 的塑料制品和槍頭避免交叉污染,。
3. RNA 在細(xì)菌細(xì)胞裂解液中時不會被RNase 降解,。但提取后繼續(xù)處理過程中應(yīng)使用不含RNase 的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150℃烘烤4 小時,，塑料器皿可在0.5 M NaOH 中浸泡10 分鐘,，然后用水*清洗，再滅菌,，即可去除RNase,。
4. 配制溶液應(yīng)使用RNase-free ddH2O。（將水加入到干凈的玻璃瓶中,，加入DEPC至終濃度0.1%（ v/v）,，混勻后放置過夜，高壓滅菌,。）
使用前注意事項(xiàng)
1. 裂解液在儲存時可能會形成沉淀,，如果有沉淀出現(xiàn),，請加熱溶解后使用。
2. *次使用前應(yīng)在漂洗液RW 中加入無水乙醇,，加入量請參見瓶上標(biāo)簽,。
操作步驟
柱平衡步驟：向吸附柱中（吸附柱放入收集管中）加入500μl 平衡液，12,000 rpm（~13,400×g ）離心1 分鐘,，倒掉收集管中的廢液,，將吸附柱重新放回收集管中備用（請使用當(dāng)天處理過的柱子）。
1． 4℃12,000 rpm（~13,400×g）離心2 分鐘收集菌體（收集菌體的zui大量不超過1×109）,，仔細(xì)去除所有培養(yǎng)基上清,。
注：如果培養(yǎng)基上清去除不*，將對第二步中的細(xì)胞壁消化過程產(chǎn)生抑制,。
2． 用含有溶菌酶的100 ul 細(xì)胞懸浮液（客戶自己配制,，配制方法見下表）*重懸菌體，孵育時間如下,。
細(xì)胞懸浮液中的溶菌酶終濃度 孵育時間（室溫）
G-細(xì)菌 400 ug/ ml 3-5 min
G+細(xì)菌 3 mg/ ml 5-10 min
3. 加入1ml 裂解液R,，渦旋振蕩混勻，若出現(xiàn)不溶性沉淀,，12000 rpm（~13,400×g）離心2 分鐘,，將上清轉(zhuǎn)移至另一離心管中。
4. 每1ml 裂解液R加0.2ml氯仿,。蓋緊樣品管蓋,，劇烈振蕩15秒并將其在室溫下孵育3分鐘。
5. 于4℃ 12,，000rpm 離心10分鐘,，樣品會分成三層：下層有機(jī)相，中間層和上層無色的水相,，RNA存在于水相中,。水相層的容量大約為所加R體積的60%，把水相轉(zhuǎn)移到吸附柱中（吸附柱套在收集管內(nèi)）,。
6. 12,，000rpm 離心45秒，棄掉廢液,，將吸附柱重新套回收集管。
7. 加入500μl漂洗液RW（請先檢查是否已加入無水乙醇!）,，12,000 rpm 離心45秒,，棄掉廢液。
8. 加入500μl漂洗液RW,，12,000 rpm 離心45秒,，棄掉廢液,。
9. 將吸附柱放回空收集管中，13,000 rpm離心2分鐘,，盡量除去漂洗液, 以免漂洗液中殘留乙醇抑制下游反應(yīng),。
10. 取出吸附柱，放入一個新的RNase free離心管中,，根據(jù)預(yù)期RNA產(chǎn)量在吸附膜的中間部位加60-100μl RNase free water,， 室溫放置2分鐘， 12,000 rpm 離心1分鐘,。得到RNA溶液,。
（洗脫體積越大，洗脫效率越高,，如果需要RNA濃度較高,，可以適當(dāng)減少洗脫體積， 但是zui小體積不少于50μl,，體積過小降低RNA洗脫效率,，減少RNA產(chǎn)量。）
RNA純度及濃度檢測
完整性： RNA 可用普通瓊脂糖凝膠電泳 （電泳條件：膠濃度1.2%,；0.5×TBE 電泳緩沖液,；150v，15 分鐘）檢測完整性,。由于細(xì)胞中70%-80%的RNA 為rRNA,，電泳后UV 下應(yīng)能看到非常明顯的rRNA 條帶。28S rRNA 的量約為18S rRNA 的兩倍,，說明RNA 的完整性較好,。
純度：OD260/OD280 比值是衡量蛋白質(zhì)污染程度的指標(biāo)。高質(zhì)量的RNA,，OD260/OD280 讀數(shù)在1.8-2.1 之間,，比值為2.0 是高質(zhì)量RNA 的標(biāo)志。OD260/OD280 讀數(shù)受測定所用溶液的pH 值影響,。同一個RNA 樣品,，假定在10mM Tris，pH7.5 溶液中測出的OD260/OD280 讀數(shù)1.8-2.1 之間,，在水溶液中所測讀數(shù)則可能在1.5-1.9 之間,，但這并不表示RNA 不純。
濃度：取一定量的 RNA 提取物,，用RNase-free ddH2O稀釋n 倍,，用RNase-freeddH2O 將分光光度計(jì)調(diào)零，取稀釋液進(jìn)行OD260, OD280 測定，按照以下公式進(jìn)行RNA濃度的計(jì)算：
終濃度（ng/μl）= （OD260）×（稀釋倍數(shù)n）×40
DNase I儲存液的配制
將DNase I 干粉（1500 U）溶解在550 μl RNase-free ddH2O 中,，輕柔混勻,，分裝后-20℃貯存（可保存9 個月）。
DNA reaction buffer：
100mM Tris-HCl（ pH 7.5 ）
25mM MgCl2
5 mM CaCl2
注意：從-20℃融化后的DNase I 儲存液保存于4℃（可保存6 周）,，不要再次凍存,。