手機(jī)版
化工儀器網(wǎng)手機(jī)版
化工儀器網(wǎng)小程序
官方微信
公眾號(hào)：chem17
掃碼關(guān)注視頻號(hào)
類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者關(guān)節(jié)中Th1/Th2型細(xì)胞因子的模式及臨床意義
類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者關(guān)節(jié)中Th1/Th2型細(xì)胞因子的模式及臨床意義
摘要：目的分析類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）患者滑膜液及外周血中Th1/Th2型細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)的偏移及其在疾病過(guò)程中的意義,。方法用酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法（enzymelinkedimmunospotassay,ELISPOT）,，檢測(cè)RA患者滑膜液?jiǎn)蝹€(gè)核細(xì)胞（SFMC）和外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）中的Th1和Th2細(xì)胞，并分析Th1/Th2細(xì)胞的比值與血沉（ESR）和C反應(yīng)蛋白（CRP）的相關(guān)性。結(jié)果與PBMC相比較,，RA患者SFMC中CD3＋T細(xì)胞的百分率,，Th1細(xì)胞及Th1/Th2細(xì)胞的比值顯著升高（P∨0.01），且此比值與患者的ESR和CRP均呈正相關(guān)（分別為r=0.84,P∨0.01和r=0.74,P∨0.02）,。結(jié)論在RA患者關(guān)節(jié)中Th1細(xì)胞明顯增多并占優(yōu)勢(shì),，Th1/Th2細(xì)胞的比值與疾病的活動(dòng)程度明顯相關(guān),，Th1/Th2細(xì)胞的平衡在RA的發(fā)病機(jī)制及疾病進(jìn)展中可能具有重要的作用,。
Abstract: Aim To analyize the shift of Th1/Th2 type cytokine profile in synovial fluid and peripheral blood from patients with rheumatoid arthritis （RA） and its clinical significance. Methods Th1 and Th2 cells in synovial fluid mononuclear cells （SFMC） and paired peripheral blood mononuclear cells （PBMC） from 12 RA patients were detected by enzyme linked immunospot assay （ELISPOT）. Correlation of Th1/Th2 cell ratio with erythrocyte sedimentation rate （ESR） and C reactive protein（CRP） were analyized. Results The mean percentages of CD3＋ T cells,Th1 cells and Th1/Th2 cell ratio were significantly increased in the SFMC as compared with PBMC（P∨ 0.01）. The Th1/Th2 cell ratio of SFMC in RA patients was correlated significantly with ESR and CRP（r=0.84, P∨ 0.01 and r=0.74,P∨ 0.02, respectively）. Conclusion The Th1 cells in joints of RA patients increased and predominated. Th1/Th2 ratio correlated markedly with the disease activity.Th1/Th2 cell balance has important implications for the pathogensis of RA.
Keywords: rheumatoid arthritis;Th1/Th2 cell;ELISPOT; cytokine ▲
類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoidarthritis,RA）是一種以慢性滑膜炎為主要特征的全身性疾病，發(fā)病機(jī)制尚不清楚,。近年研究表明,，輔助性T細(xì)胞（Th1/Th2）在RA的發(fā)病機(jī)制中有重要的作用〔1〕,，并在基因水平上分析了RA患者Th1/Th2型細(xì)胞因子的表達(dá)〔2〕。為了深入探討Th1/Th2細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子在RA患者體內(nèi)的表達(dá)模式及臨床意義,，我們采用ELISPOT法,，在單細(xì)胞水平檢測(cè)了RA患者滑膜液中單個(gè)核細(xì)胞（SFMC）和外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）中Th1/Th2細(xì)胞的分布，并分析了其與患者疾病活動(dòng)程度的相關(guān)性,。
1 材料和方法
1．1材料SFMC及PBMC取自12例活動(dòng)期RA患者〔平均受累關(guān)節(jié)為（5.2±3.6）個(gè),，病程為（8.4±7.5）年,ESR為（61.2±24.2）mm/h，CRP為（32.2±17.5）mg/L〕,。10例類風(fēng)濕因子（RF）陽(yáng)性,，2例陰性。RA根據(jù)1987年美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)（ACR）修訂的標(biāo)準(zhǔn)而確診〔3〕,?；ひ河上リP(guān)節(jié)無(wú)菌穿刺抽取，平均白細(xì)胞計(jì)數(shù)為（17.3.±9.7×109）個(gè)/L,。以5份健康成人血液標(biāo)本的PBMC作為陰性對(duì)照,。CD3/CD4/CD8檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京邦定泰克公司。小鼠抗人IFN-γ和抗人IL-4mAb購(gòu)自美國(guó)RD公司,。生物素鏈霉卵白素/堿性磷酸酶試劑盒，購(gòu)自LabVision公司,。多聚甲醛,、皂素、PMA,，離子霉素,、莫能菌素和透明質(zhì)酸酶，均購(gòu)自Sigma公司,。淋巴細(xì)胞分離液為上海*生化制品廠產(chǎn)品,，RPMI1640培養(yǎng)液為Gibco公司產(chǎn)品。
1．2方法
1．2．1SFMC和PBMC的分離和培養(yǎng)取EDTA抗凝的滑膜液，每mL加入10U透明質(zhì)酸酶,，37℃孵育30min以降低粘度,。以等量生理鹽水稀釋后,用淋巴細(xì)胞分離液按密度梯度離心法分離SFMC。PBMC按常規(guī)密度梯度離心法分離,。將所獲SFMC或PBMC以2×109/L的密度懸浮于含100mL/L胎牛血清（FCS）的RPMI1640中,。取24孔培養(yǎng)板（NUNC，丹麥）,，每孔加1mL細(xì)胞懸液,，20μg/LPMA，1μmol/L離子霉素（ionomycin）及2μmol/L莫能菌素（monensin）,，于37℃50mL/LCO2條件下培養(yǎng)6h,。收集培養(yǎng)的細(xì)胞，以PBS洗兩次,，用離心涂片機(jī)制成細(xì)胞涂片,，檢測(cè)細(xì)胞的表面標(biāo)志及細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞因子。
1.2．2細(xì)胞表面標(biāo)志的檢測(cè)SFMC和PBMC表面CD3,，CD4和CD8的檢測(cè),，采用邦定公司的T淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)試劑盒（APAAP法），按說(shuō)明書進(jìn)行,。細(xì)胞表面有紅色標(biāo)記物者即為陽(yáng)性細(xì)胞,。
1．2．3細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子的檢測(cè)按文獻(xiàn)〔4〕的方法進(jìn)行，主要步驟為：細(xì)胞涂片用40mL/L多聚甲醛（PFA）固定30min,，再以100mL/L正常羊血清封閉10min,，加1g/L皂素PBS150μL通透10min，以使抗細(xì)胞因子單抗易于進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),，然后加抗IFN-γmAb0.5μg或抗IL4mAb0.25μg（陰性對(duì)照用PBS代替）,，4℃反應(yīng)過(guò)夜。用PBS沖洗后,，每片加生物素標(biāo)記的羊抗小鼠IgG（二抗）50μL,，室溫反應(yīng)30min。zui后加鏈霉卵白素－堿性磷酸酶復(fù)合物50μL,，室溫反應(yīng)30min,，用堅(jiān)固紅溶液顯色、蘇木精復(fù)染后,，甘油明膠封片,、鏡檢（日本NikonOPTIPHOT）并照像。結(jié)果用 ±s表示,，并做t檢驗(yàn),。Th1/Th2細(xì)胞的比值與ESR和CRP的結(jié)果做直線相關(guān)分析,。
2 結(jié)果
2.1SFMC和PBMC的表型分析對(duì)12例RA患者SFMC和PBMC上CD3，CD4和CD8檢測(cè)的結(jié)果表明,，SFMC中CD3＋細(xì)胞的比率顯著高于PBMC（分別為:81％±11％和53％±8％,，P∨0.01），但CD4＋和CD8＋細(xì)胞的比率并無(wú)明顯差異（P∧0.05）,。
2.2SFMC和PBMC中Th1和Th2細(xì)胞的陽(yáng)性率
用PMA/離子霉素刺激培養(yǎng)后,，做ELISPOT染色，結(jié)果如圖1所示,。以IFN-γ＋細(xì)胞代表Th1細(xì)胞,，IL4＋細(xì)胞代表Th2細(xì)胞，每張涂片計(jì)數(shù)500個(gè)淋巴細(xì)胞中陽(yáng)性細(xì)胞的百分率,。RA患者SFMC中,，Th1細(xì)胞的平均陽(yáng)性率明顯高于PBMC（分別為：25.4％±6.6％和10.8％±2.6％,P∨0.01）；而Th2細(xì)胞的平均陽(yáng)性率無(wú)顯著差異（分別為：4.6％±2.7％和4.5％±2.1％,P∧0.1,，圖2）,。另外，12例RA患者的PBMC與5例正常人的PBMC相比較,，Th1和Th2細(xì)胞的陽(yáng)性率也無(wú)顯著差異（Th1細(xì)胞分別為：10.8％±2.6％和12.6％±3.6％,P∧0.3;Th2細(xì)胞分別為：4.5％±2.1％和4.8％±1.8％,，P∧0.7）。
2.3SFMC和PBMC中Th1/Th2細(xì)胞的比值RA患者SFMC中,，Th1/Th2細(xì)胞的比值明顯高于PBMC中的比值（分別為：7.3±4.2和3.1±2.1,P∨0.01）,與正常人PBMC中Th1/Th2細(xì)胞的比值（2.9±1.2）相比較,，亦差異顯著（P∨0.01，圖3）,。
2.4Th1/Th2細(xì)胞比值與CRP和ESR的相關(guān)性以CRP和ESR作為兩種衡量RA活動(dòng)程度的敏感指標(biāo),，將它們分別與Th1/Th2細(xì)胞的比值做相關(guān)分析。結(jié)果表明,，RA患者SFMC中Th1/Th2細(xì)胞的比值與CRP和ESR均呈正相關(guān)（分別為r=0.74,P∨0.02和r=0.84,P∨0.01）（圖4）,。
圖1RA患者SFMC中的CD3＋,IFN-γ＋和IL-4＋T細(xì)胞
Fig 1 CD3＋ , IFN γ ＋ and IL 4＋ T cells in SFMC from RA patients
A:CD3＋ T cells in SFMC of RA patients （APAAP， × 400）; B: IFN γ ＋ T cells （Th1 cells） in SFMC of RA patients.Positive cells are characterized by some distinct red spots next to the nucleus （ELISPOT,， × 400）; C:IL 4＋ T cells （Th2 cells）in SFMC of RA patients（ELISPOT,， × 600）.
圖2RA患者SFMC及PBMC中IFN-γ＋和IL-4＋T細(xì)胞的
百分率（％） bP∨0.01vsPBMC.
Fig 2 Percentages of IFN-γ＋and IL-4＋ T cells in SFMC and PBMC from RA patients
圖3RA患者SFMC,PBMC及正常人（N）PBMC中Th1/
Th2細(xì)胞的比值
Fig 3 Th1/Th2 cell ratio in SFMC and PBMC from RA pa tients and normal control bP∨ 0.01 vs PBMC（RA） and PBMC（N）.
Fig 4 Correlation of Th1/Th2 cell ratio in SFMC to ESR and CRP of RA patients
圖4RA患者SFMC中Th1/Th2細(xì)胞的比值與ESR和
CRP的相關(guān)性
3 討論
正常人的Th1/Th2型細(xì)胞因子處于平衡狀態(tài)，而RA患者的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)則發(fā)生偏移,。因此有人認(rèn)為,，促炎性Th1細(xì)胞及其分泌的IFNγ和抗炎性Th2細(xì)胞及其分泌的IL4的失衡，在RA的發(fā)病機(jī)制中具有重要的作用〔6〕,。本文的結(jié)果表明，RA患者SFMC中Th1細(xì)胞的數(shù)明顯高于其自身及正常人PBMC中的Th1細(xì)胞數(shù),。即在RA患者的關(guān)節(jié)中,，Th1細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子占顯著優(yōu)勢(shì),，與一些學(xué)者推測(cè)的“Th1漂移（Th1shift）學(xué)說(shuō)”相符合〔7〕，提示RA為器官特異性的自身免疫病,。本研究還表明,，RA患者SFMC中Th1/Th2細(xì)胞的比值明顯升高，且與ESR和CRP呈正相關(guān),。zui近有作者報(bào)道,血中Th1/Th2細(xì)胞的比值在RA病程進(jìn)展中的作用,，并認(rèn)為Th1細(xì)胞有使RA患者病情慢性化的作用，而Th2細(xì)胞則主要起保護(hù)性作用〔8〕,，因此,，檢測(cè)Th1/Th2細(xì)胞的比值對(duì)評(píng)價(jià)RA患者的預(yù)后具有一定的意義。應(yīng)用膠原性關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型表明,，IL-4/IL-10（Th2型細(xì)胞因子）聯(lián)合治療,，能使動(dòng)物體內(nèi)的Th0細(xì)胞向Th2細(xì)胞轉(zhuǎn)化，并使病情顯著好轉(zhuǎn)〔9〕,，因此,，恢復(fù)關(guān)節(jié)內(nèi)Th1/Th2細(xì)胞的平衡可能是控制RA慢性炎癥的一條新途徑。
采用ELISPOT法,，通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞因子而確定Th1/Th2細(xì)胞比值的基本原理是,，莫能菌素可阻斷細(xì)胞因子向胞膜外轉(zhuǎn)運(yùn)，使之滯留在胞漿中,，而并不影響細(xì)胞因子的合成,，因此可用于檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的IFN-γ和IL-4。由于進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的抗IFN-γ和IL-4抗體與之結(jié)合,，通過(guò)第二抗體和生物素親合素放大系統(tǒng),，在胞漿內(nèi)可形成顆粒狀斑點(diǎn)，用免疫組化染色方法即可顯示,。因此,，ELISPOT法具有靈敏、簡(jiǎn)便和形象直觀等優(yōu)點(diǎn),，是檢測(cè)Th細(xì)胞亞群比值的一種值得推廣的好方法〔10〕,。
相關(guān)產(chǎn)品
免責(zé)聲明
- 凡本網(wǎng)注明“來(lái)源：化工儀器網(wǎng)”的所有作品，均為浙江興旺寶明通網(wǎng)絡(luò)有限公司-化工儀器網(wǎng)合法擁有版權(quán)或有權(quán)使用的作品,，未經(jīng)本網(wǎng)授權(quán)不得轉(zhuǎn)載,、摘編或利用其它方式使用上述作品。已經(jīng)本網(wǎng)授權(quán)使用作品的,，應(yīng)在授權(quán)范圍內(nèi)使用,，并注明“來(lái)源：化工儀器網(wǎng)”。違反上述聲明者,，本網(wǎng)將追究其相關(guān)法律責(zé)任,。
- 本網(wǎng)轉(zhuǎn)載并注明自其他來(lái)源（非化工儀器網(wǎng)）的作品,，目的在于傳遞更多信息，并不代表本網(wǎng)贊同其觀點(diǎn)和對(duì)其真實(shí)性負(fù)責(zé),，不承擔(dān)此類作品侵權(quán)行為的直接責(zé)任及連帶責(zé)任,。其他媒體、網(wǎng)站或個(gè)人從本網(wǎng)轉(zhuǎn)載時(shí),，必須保留本網(wǎng)注明的作品第一來(lái)源,，并自負(fù)版權(quán)等法律責(zé)任。
- 如涉及作品內(nèi)容,、版權(quán)等問(wèn)題,，請(qǐng)?jiān)谧髌钒l(fā)表之日起一周內(nèi)與本網(wǎng)聯(lián)系，否則視為放棄相關(guān)權(quán)利,。
采購(gòu)中心