基本實驗步驟：

（1） 細胞準備,。對單層生長細胞,，在傳代培養(yǎng)時,，將細胞接種到預先放置有處理過的蓋玻片的培養(yǎng)皿中,，待細胞接近長成單層后取出蓋玻片,，PBS洗兩次,；對懸浮生長細胞，取對數(shù)生長細胞,，用PBS離心洗滌（1000rpm,，5min）2次，用細胞離心甩片機制備細胞片或直接制備細胞涂片,。

（2） 固定,。根據(jù)需要選擇適當?shù)墓潭▌┕潭毎９潭ㄍ戤吅蟮募毎芍糜诤B氮納的PBS中4℃保存3個月,。PBS洗滌3×5 min,。

（3） 通透。使用交聯(lián)劑（如多聚甲醛）固定后的細胞,，一般需要在加入抗體孵育前,，對細胞進行通透處理，以保證抗體能夠到達抗原部位,。選擇通透劑應充分考慮抗原蛋白的性質(zhì),。通透的時間一般在5-15min。通透后用PBS洗滌3×5 min,。

（4） 封閉,。使用封閉液對細胞進行封閉，時間一般為30min,。

（5） 一抗結(jié)合,。室溫孵育1h或者4℃過夜,。PBST漂洗3次，每次沖洗5min,。

（6） 二抗結(jié)合,。間接免疫熒光需要使用二抗。室溫避光孵育1h,。PBST漂洗3次,，每次沖洗5min后，再用蒸餾水漂洗一次,。

（7） 封片及檢測,。滴加封片劑一滴，封片,，熒光顯微鏡檢查,。

（一）細胞準備

用于免疫熒光實驗的細胞可以是直接生長在蓋玻片上的貼壁細胞，也可以是經(jīng)過離心后涂片的懸浮細胞或者是將取自體內(nèi)的組織細胞懸液離心后涂片,。貼壁良好的細胞一般在培養(yǎng)時直接放入coverslips讓細胞生長在其上即可,，盡量避免使用貼壁性能不好的細胞進行免疫熒光實驗，以免后續(xù)的漂洗操作引起細胞脫落,。少數(shù)實驗需要使用這類細胞或者懸浮細胞進行免疫熒光觀察,，建議使用細胞離心甩片機制備細胞片或直接制備細胞涂片。

（二）固定和通透www.shkbsw.com
 

除研究細胞表面抗原或不穩(wěn)定抗原可不固定外,，一般均應固定,。固定的目的有三：

①防止細胞從玻片上脫落；

②除去防礙抗原-抗體結(jié)合的類脂,；

③使標本易于保存,。

標本的固定原則是：

①不能損傷細胞內(nèi)的抗原；

②不能凝集蛋白質(zhì),；

③應保持細胞和亞細胞結(jié)構(gòu),；

④固定后應保持通透性，以保證抗體自由進入所有細胞與亞細胞組分與抗原結(jié)合,。

常用的固定劑有多種,，應根據(jù)所研究抗原的性質(zhì)和所使用的抗體特性選擇適當?shù)墓潭▌Ｍǔ９潭ǚ椒梢苑譃閮深悾河袡C溶劑和交聯(lián)劑,。有機溶劑如甲醇和丙酮等可去除類脂并使細胞脫水,，同時將細胞結(jié)構(gòu)蛋白沉淀。交聯(lián)劑如多聚甲醛通常通過自由氨基酸基團形成分子間橋連,，從而產(chǎn)生一種抗原相互連接的網(wǎng)絡結(jié)構(gòu),。交聯(lián)劑比有機溶劑更易于保持細胞的結(jié)構(gòu)，但因為交聯(lián)阻礙抗體結(jié)合,，可能會降低一些細胞組分的抗原性,，因此需要增加一個通透步驟以使抗體能夠進入標本,。兩種固定方法都可能使蛋白抗原變性，因此使用變性蛋白作為抗原生產(chǎn)的抗體在免疫熒光中可能更為有效,。

zui常用的固定劑有多聚甲醛和甲醇,，少數(shù)情況也使用乙醇，丙酮及戊二醛等進行固定,。通常,，細胞結(jié)構(gòu)抗原、病毒及一些酶類抗原使用丙酮,、乙醇及高濃度的甲醛固定可獲得較好的結(jié)果,，而細胞膜相關(guān)組分抗原一般以多聚甲醛固定。細胞器和細胞顆粒內(nèi)的抗原一般也用多聚甲醛固定,，并需要進行通透以使抗體能達到抗原表位,。

通透步驟只在檢測細胞內(nèi)抗原表位的時候才需要，因為抗體需要進入細胞內(nèi)部去檢測蛋白,。但是,，如果待檢測的是跨膜蛋白，且其抗原表位處于胞質(zhì)內(nèi)區(qū)域,，則同樣需要對細胞進行通透,。相反，如果所檢測的抗原表位位于膜蛋白的胞外段,，則不需要進行通透。丙酮本身具有通透作用,，因此用丙酮作為固定劑時是不需要通透的,。甲醇同樣具有通透作用，但有些場合并不適合用甲醇,，因為一些表位對甲醇非常敏感,。常用的通透劑是去垢劑，如Triton ,，NP-40,，以及Tween 20, Saponin, Digitonin 和 Leucoperm等。Triton和NP-40屬于烈性去垢劑,，可部分溶解細胞核膜,，因此非常適合核抗原檢測。但應該注意的是,，如果在高濃度下使用或者作用時間過長,，它們將破壞蛋白，從而影響實驗結(jié)果,。Triton X-100是zui常用的通透劑,，但是它將破壞細胞膜,，因此不適用于細胞膜相關(guān)抗原。后面一組去垢劑要溫和得多,，它們可以在細胞質(zhì)膜上形成足夠大的孔隙以允許抗體通過,，但是不會溶解細胞質(zhì)膜。適于胞質(zhì)抗原或者質(zhì)膜上靠近胞質(zhì)一面的抗原,，也適于可溶性的核抗原,。

一般的操作程序是先固定后通透，但針對有些水不溶性的目的抗原的檢測宜先通透再固定,，這樣做的原因主要是可以通過通透去除許多水溶性的蛋白,，從而大大減少了免疫熒光的背景和非特異性信號。固定后以冷PBS液漂洗,，zui后以蒸餾水沖洗,，防止自發(fā)性熒光。

（三）封閉

封閉的目的是為了減少抗體的非特異性結(jié)合,，zui常用的封閉劑為1% BSA, PBS pH 7.5,，其他可選擇的封閉劑還有 1% gelatin, 1%bovine 或與二抗種屬相同的血清（3-10%）等。

（四）抗體孵育

直接免疫熒光法中的一抗和間接免疫熒光法中的二抗都是熒光抗體,，因此在這些抗體孵育的時候必須注意避光,。此外，為保證結(jié)合質(zhì)量和防止干燥,，抗體孵育應盡量在濕盒中進行,。

（五）封片及熒光觀察

標記好熒光的細胞片原則上可以直接進行觀察，特別是有時候封片不當反而使得前功盡棄,。但在絕大多數(shù)情況下,，為了保存結(jié)果，以便進一步觀察,、照像,、統(tǒng)計分析等，需作封片處理,。常規(guī)的方法是采用甘油或中性樹脂封片,，為了增強封片的效果，往往需要在封片時添加特殊的抗熒光淬滅劑,。

（六）標本保存

由于熒光色素和蛋白質(zhì)分子的穩(wěn)定性都是相對的,，因此隨著保存時間的延長，在各種條件影響下,，標記蛋白可能變性解離,，失去其應有的亮度和特異性。因此給標本的保存帶來一定的困難,，所以在標本進行熒光染色之后應立即觀察,。由于性能良好的抗熒光淬滅劑的出現(xiàn),，熒光標記的標本可以在低溫（4℃或-20℃）下保存相當長的時間。在某些情形下,，考慮到實驗的成本及實驗條件,，也可以采取權(quán)宜的辦法，比如固定標本片后低溫保存,，在需要時再進行熒光標記,，即隨用隨染