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副豬嗜血桿菌檢測試劑盒(熒光PCR法)說明書

來源:上海臻科生物科技有限公司   2025年07月09日 09:51  

副豬嗜血桿菌檢測試劑盒(熒光PCR法)說明書

 

【產(chǎn)品名稱】

通用名稱:副豬嗜血桿菌檢測試劑盒(實時熒光PCR法)

英文名稱Haemphilus parasuis Detection Kit (Real-Time PCR Method)

【包裝規(guī)格】 25T/  50T/

【預期用途】

副豬嗜血桿菌(Haemophilus parasuis,HPS)是豬上呼吸道一種常在菌,在一定條件下可引起嚴重的全身性疾病,。本試劑盒利用實時熒光PCR原理,定性檢測副豬嗜血桿菌,對副豬嗜血桿菌的診斷和監(jiān)控具有重要指導意義,。

【檢驗原理】

本試劑盒針對副豬嗜血桿菌肺炎基因設(shè)計特異性引物和探針,在反應體系中含有副豬嗜血桿菌 DNA模板的情況下,,PCR反應得以進行并釋放熒光信號,。利用儀器對PCR過程中相應通道的信號強度進行實時監(jiān)測和輸出,實現(xiàn)檢測結(jié)果的定性分析,。

【主要組成成份】

序號

組成

25T/

50T/

1

HPS  PCR反應液

500 μL×1

1000 μL×1

2

HPS 陽性對照

40 μL×1

40 μL×1

3

HPS 陰性對照

40 μL 1

40 μL×1

4

說明書

1

1

注:陰性對照為滅菌純水,,陽性對照為副豬嗜血桿菌靶基因的質(zhì)粒

【儲存條件及有效期】避光-20以下保存,,避免反復凍融,,有效期12個月。

【適用儀器】ABI 系列,、Bio-Rad系列,、Agilent Stratagene MX系列 Roche LightCycler R480,、Cepheid SmartCycler,、Rotor-Gene系列、杭州博日系列等多通道實時熒光定量PCR儀,。

【樣本要求】

1. 樣本要求:標本(鼻拭子,、菌落、菌苔等)應為新鮮采集并使用雙蒸滅菌水或滅菌生理鹽水懸浮的原始標本,,或心包液,、胸腹腔積液、關(guān)節(jié)液等無菌收集數(shù)毫升,或取少量肺臟樣品(23克)研磨后入無菌離心管中,,3000 rpm 離心10分鐘取上清待檢,。

2. 標本收集后若不能立即檢測,可置于28℃冷藏過夜保存,;如需長期保存,,標本應凍存于-20℃-80℃

3. 標本保存期間應避免反復凍融,。

【檢驗方法】

1. 試劑準備(試劑準備區(qū))

1)從冰箱中取出試劑盒, 從試劑盒中取出實驗所需試劑,充分融化混勻并瞬時離心以去除管壁附著液體,。

2)核算當次實驗所需要的反應數(shù)(n),并根據(jù)如下表所示反應體系計算當次實驗所需要的各種試劑量,。

n =陰性對照數(shù)(1T+陽性對照數(shù)(1T+誤差預留量(1T+樣本數(shù)

單反液配制表(每份)

PCR反應液UNG酶及Taq酶)

20 μL

3)在無菌離心管中加入上述試劑,,充分混勻后瞬時離心。按照20 μL/管分裝量將試劑分裝至PCR反應管,。

4)蓋緊PCR反應管蓋后將PCR反應管轉(zhuǎn)移至樣本處理區(qū),。 剩余試劑放回-20以下冰箱冷凍保存。

2.樣本準備(樣本處理區(qū))

DNA/RNA提取試劑盒提取核酸即可,,具體操作按照其試劑盒說明書操作,。

3.加樣

在上述制備好的PCR反應樣本管中分別加入處理好的待測標本DNA5μl、終體積25μl/管,,蓋好PCR反應蓋混勻后瞬時低速離心,,轉(zhuǎn)移到PCR儀器上。陰性對照和陽性對照管則各加5μL試劑盒自帶的陰性對照或陽性對照品,,終體積為25μl/管,,蓋好PCR反應蓋混勻后瞬時低速離心,轉(zhuǎn)移到PCR儀器上,。

4.PCRPCR擴增區(qū))

1)取樣本處理區(qū)準備好的PCR反應管,,放置在實時熒光定量PCR儀樣品槽相應位置,并記錄放置順序,。

2)按下表設(shè)置儀器核酸擴增相關(guān)參數(shù)進行PCR擴增。

反應體積

25 μL

通道選擇

FAM通道采集 HPS 熒光信號

PCR

反應

條件

步驟

條件

循環(huán)數(shù)

UNG處理

 372分鐘(min

1

預變性

 953分鐘(min

1

PCR擴增

955秒(s

40

5540秒(s

(此階段結(jié)束時采集熒光信號)


【參考值(參考范圍)】

1.試劑盒有效性判定:

1)陽性對照:有典型S型擴增曲線或Ct≤35,。

2)陰性對照:Ct值>38或無Ct值,,線形為直線或輕微斜線,無指數(shù)增長期,。

2.標本結(jié)果判定:

1陽性:標本檢測結(jié)果Ct≤35或有明顯指數(shù)增長期,。

2)可疑:標本檢測結(jié)果Ct值在3538范圍內(nèi)。此時應對標本進行重復檢測,,如重復實驗結(jié)果Ct值仍在3538范圍內(nèi),,有明顯指數(shù)增長期,則判定為陽性,否則為陰性,。

3)陰性:標本檢測結(jié)果Ct值>38或無Ct值,。

【檢驗結(jié)果的解釋】

通道及檢測結(jié)果

標本檢測結(jié)果解釋

FAM

陽性(+)

標本中檢測出HPS

陰性(-)

標本中未檢出HPS

【檢驗方法的局限性】

1. 當檢測樣本中被檢核酸濃度低于本試劑盒的di檢出xian可能會發(fā)生假陰性的結(jié)果。

2. 被檢樣本在采集,、運輸,、儲存以及處理過程中操作方式不當容易造成DNA降解而產(chǎn)生假陰性結(jié)果。

3. 樣本在采集,、運輸,、儲存以及處理過程中發(fā)生交叉污染,則容易得到假陽性結(jié)果,。

【產(chǎn)品性能指標】 產(chǎn)品的di檢出限為103Copies/mL,,產(chǎn)品CV3%

【注意事項】

1. 使用本試劑盒的實驗室,,應嚴格按照國家有關(guān)部分頒布的有關(guān)基因擴增檢驗實驗室管理規(guī)范進行管理,;

2. 為避免RNA降解,樣本處理過程應在0-4℃條件下操作,,且完成實驗后立即上機檢測,;樣本處理過程中使用的器具耗材應經(jīng)過無核酶處理

3. 各區(qū)域物品均為專用,,不得交叉使用,,以免污染檢測結(jié)束后,,應立即對工作臺清潔,;

4. 吸取反應液時,應盡量避免產(chǎn)生氣泡,; PCR 儀前,,應注意檢查各反應管是否蓋緊,以免液體蒸發(fā)造成結(jié)果不準確,;

5. 試劑盒所有試劑在使用前應該在常溫下充分融化混勻,,并應瞬時離心;

6. 試劑盒內(nèi)所配陰性和陽性對照在第一次使用前應全部轉(zhuǎn)移至標本準備區(qū),,并單獨存放,;

7. 為防止熒光干擾,應避免裸手直接接觸PCR反應管,,并應避免在PCR反應管上進行任何標記,;

8. 檢測過程中使用過的吸頭,應直接打到盛有 10%次氯酸的廢物缸內(nèi),,檢測結(jié)束的PCR 反應管,,切忌開蓋,并與其他廢棄物品一同滅菌后丟棄工作臺及各種實驗用品應定期用 10%次氯酸,、75%酒精或紫外燈進行消毒,;

9. 儀器擴增相關(guān)參數(shù)應按照本說明書相關(guān)要求進行設(shè)置;不同批號試劑不能混用,;并在有效期內(nèi)使用,。 



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