一,、背景

嗜冷黃桿菌PCR試劑盒是一種常用的分子生物學(xué)工具,，它可以幫助科研人員快速、準(zhǔn)確地檢測和鑒定嗜冷黃桿菌。

通過使用針對(duì)嗜冷黃桿菌的PCR試劑盒,，研究人員可以特異性地?cái)U(kuò)增嗜冷黃桿菌的DNA片段,，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)該物種的準(zhǔn)確檢測。這種檢測方法具有較高的靈敏度和特異性,，可以檢測出痕量嗜冷黃桿菌的存在,，同時(shí)避免其他微生物的干擾。

二,、嗜冷黃桿菌PCR試劑盒操作步驟

（一）稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品（以10E2-10E7拷貝/μL這6個(gè)10倍稀釋度為例）,。由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行,，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）,。

1、標(biāo)記6個(gè)離心管,，分別為7,，6，5,，4,，3，2,。

2,、用帶芯槍頭分別加入45μL熒光PCR專用模板稀釋液，用帶芯槍頭,，下同）,。

3、在7號(hào)管中加入5μL陽性對(duì)照（濃度為1×10E8拷貝/μL,，試劑盒提供),，充分震蕩1分鐘，得1×10E7拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品,。放冰上待用,。

4、換槍頭,，在6號(hào)管中加入5μL1×10E7拷貝/μL的陽性對(duì)照(上步稀釋所得),，充分震蕩1分鐘，得1×10E6拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品,。放冰上待用,。

5、換槍頭,，在5號(hào)管中加入5μL1×10E6拷貝/μL的陽性對(duì)照(上步稀釋所得),，充分震蕩1分鐘,，得1×10E5拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用,。

6,、重復(fù)上面的操作直到得到6個(gè)稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用,。

（二）樣品DNA的制備

7,、用自選方法純化樣品的DNA，本產(chǎn)品跟市場上絕大多數(shù)核酸純化產(chǎn)品兼容,。

8,、如果有N個(gè)樣品，則需要進(jìn)行N+2個(gè)樣品提取,，多出的一個(gè)用作樣品制備陽性對(duì)照管,、另一個(gè)用作樣品制備陰性對(duì)照管。

（三）設(shè)置qPCR反應(yīng)（20μL體系,，在樣品制備室進(jìn)行）

9,、如果做定量分析并且只做1次重復(fù)，則標(biāo)記N+9個(gè)PCR管,，其中N+2個(gè)用于上步得到的N+2個(gè)樣品,，1個(gè)用于PCR陰性對(duì)照（用水做模板），6個(gè)用于標(biāo)準(zhǔn)曲線,。如果做定性分析,，并且只做1次重復(fù)，則標(biāo)記N+4個(gè)PCR管,，其中N+2個(gè)用于上步得到的N+2個(gè)樣品，1個(gè)用于PCR陰性對(duì)照（用水做模板）,，1個(gè)用于PCR陽性對(duì)照（用步稀釋得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線系列稀釋液的第4號(hào)做模板）,。下面只以定量分析為例描述操作步驟。

10,、在標(biāo)記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù)）：

（四）數(shù)據(jù)處理

11,、如果把嗜冷黃桿菌PCR試劑盒用于定量檢測，則以陽性對(duì)照濃度的log值為橫軸,，以Ct值為縱軸,，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測樣品的Ct值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品DNA濃度的log值,，再推算出其濃度,。

12、如果把嗜冷黃桿菌PCR試劑盒用于定性檢測,，只判斷陽性或陰性,，則陰性對(duì)照Ct必須大于或等于40。陽性對(duì)照必須有熒光對(duì)數(shù)增長，有典型擴(kuò)增曲線,，Ct值應(yīng)該小于或等于30,。對(duì)待測樣品，如果其Ct大于或等于40則為陰性,，如果小于或等于35則為陽性,。如果在35-40之間，則重復(fù)一次,。重復(fù)實(shí)驗(yàn)的Ct值如果大于或等于40則為陰性,，如果小于40，則為陽性

三,、應(yīng)用

嗜冷黃桿菌PCR試劑盒可以用于虹鱒源嗜冷黃桿菌的生物學(xué)特性及其致病性研究：

實(shí)驗(yàn)從患病虹鱒潰爛肌肉處分離到2株細(xì)菌,命名為CH06和CH07株,并對(duì)分離菌株的理化特性,、分類地位、致病性和耐藥性開展了深入研究,以期為該病的防控提供參考,。

結(jié)果表明,CH06和CH07株在胰蛋白酵母提取物(tryptone yeast extract salts,TYES)瓊脂平板上呈煎蛋狀外觀,產(chǎn)黃色素,氧化酶和過氧化氫酶陽性,能水解明膠和酪蛋白,不能水解淀粉,不能利用果糖,、半乳糖和七葉苷等。16S r RNA比對(duì)結(jié)果顯示,CH06和CH07株與嗜冷黃桿菌模式株NBRC 15942的同源性分別為99.35%和99.42%,。

本研究還探索了嗜冷黃桿菌肌肉注射感染虹鱒(Oncorhynchus mykiss)后病原菌在魚組織內(nèi)的動(dòng)態(tài)分布情況,以期為BCWD的防控提供理論支撐,。以1.0×108CFU/m L濃度的嗜冷黃桿菌CH06株菌液肌肉注射感染實(shí)驗(yàn)虹鱒,感染后12 h、24h,、96 h觀察虹鱒臨床癥狀及組織病變,并利用嗜冷黃桿菌PCR試劑盒檢測各組織病原載量,。

患病魚的臨床病征表現(xiàn)為體色發(fā)黑,游動(dòng)緩慢或不動(dòng),食欲不振,尾柄部注射處肌肉潰爛,鰓蒼白,脾臟腫大,伴有腹水。組織病理觀察顯示,嗜冷黃桿菌感染后實(shí)驗(yàn)魚注射處肌纖維斷裂,、溶解;脾竇擴(kuò)張,其內(nèi)充滿紅細(xì)胞;腎臟組織含鐵血黃素增加,出現(xiàn)大量空泡變性,腎小管上皮細(xì)胞變性,、壞死,腎間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤。嗜冷黃桿菌PCR試劑盒檢測結(jié)果表明,肌肉注射感染12 h后即可在脾臟,、肝臟,、腎臟、腸道,、鰓,、腦和尾鰭中檢出嗜冷黃桿菌,鰓病原載量為(1.62±0.28)×103copy/μL。

感染后24 h,脾臟,、腦中病原載量較12 h時(shí)上升最多,其他組織病原載量與感染12 h時(shí)水平一致,脾臟病原載量為(1.26±0.37)×104copy/μL,顯著高于其他組織(P<0.05),。感染96 h后脾臟中的病原載量顯著高于其他組織(P<0.05),達(dá)到(1.15±0.58)×107copy/μL;肝臟、腎臟,、脾臟中的病原載量較24 h時(shí)上升最多,。所有被檢組織中病原菌載量隨時(shí)間延長均呈上升趨勢(shì)。另外,三個(gè)時(shí)間點(diǎn)脾臟的病原平均載量,其次為腎臟,然后是鰓,。嗜冷黃桿菌人工感染虹鱒后,脾臟是細(xì)菌的重要增殖場所,。

北京百歐博偉生物技術(shù)有限公司的微生物菌種查詢網(wǎng)提供微生物菌種保藏,、測序、購買等服務(wù),是中國微生物菌種保藏中心的服務(wù)平臺(tái),，并且是集微生物菌種,、菌種,ATCC菌種、細(xì)胞,、培養(yǎng)基為一體的大型微生物查詢類網(wǎng)站,，自設(shè)設(shè)備及技術(shù)的微生物菌種保藏中心！歡迎廣大客戶來詢,！