貓泛白細胞減少癥檢測試劑盒（實時熒光PCR法）說明書

【產(chǎn)品名稱】

通用名稱：貓泛白細胞減少癥檢測試劑盒（實時熒光PCR法）

英文名稱：Feline Pan Leukopenia Detection Kit (Real-Time PCR Method)

【包裝規(guī)格】 25T/盒 & 50T/盒

【預(yù)期用途】

貓瘟又稱貓泛白細胞減少癥,、貓傳染性腸炎,，是貓的一種急性高度接觸性傳染病，本試劑盒利用實時熒光PCR原理,，主要用于貓瘟病毒的定性篩查檢測及療效評估有重要指導(dǎo)意義,。

【檢驗原理】

本試劑盒針對貓瘟基因設(shè)計特異性引物和分子信標探針，在待檢樣本中含有貓瘟DNA的情況下,，PCR反應(yīng)得以進行并釋放熒光信號,。利用儀器對PCR過程中相應(yīng)熒光信號進行實時監(jiān)測和輸出，實現(xiàn)檢測結(jié)果的定性分析,。

【主要組成成份】

注：陰性對照為滅菌純水,，陽性對照為含貓泛白細胞減少癥靶基因的質(zhì)粒。

【儲存條件及有效期】避光-20℃以下保存,，避免反復(fù)凍融,，有效期12個月。

【適用儀器】ABI 系列,、Bio-Rad系列,、Agilent Stratagene MX系列、Roche LightCycler 480,、Cepheid SmartCycler,、Rotor-Gene系列、杭州博日系列等多通道實時熒光定量PCR儀,。

【樣本要求】

1.樣品取口腔潰瘍面拭子,、結(jié)膜拭子、排泄物采集方法如下：

(1) 口腔潰瘍面拭子：用棉簽擦拭舌,、硬腭,、腭中裂周圍，同樣將棉簽頭浸入2-4 ml采樣液中,，尾部棄去,。

(2) 結(jié)膜拭子：用棉簽擦拭眼周圍分泌物，同樣將棉簽頭浸入2-4 ml采樣液中,，尾部棄去,。

2.血液、血漿樣品：使用無菌注射液抽取樣品置于離心管中待檢,。

3.淋巴結(jié),、肺等組織樣品：取少量樣品（2~3克）于研缽或勻漿器中研磨,，然后將研磨勻漿轉(zhuǎn)入無菌離心管中，3000rpm/min離心10分鐘取上清待檢,。

4.應(yīng)避免標本間交叉污染,。

【檢驗方法】

1. 試劑準備（試劑準備區(qū)）

（1）從冰箱中取出試劑盒, 從試劑盒中取出實驗所需試劑，充分融化混勻并瞬時離心以去除管壁附著液體,。

（2）核算當次實驗所需要的反應(yīng)數(shù)（n）,，并根據(jù)如下表所示反應(yīng)體系計算當次實驗所需要的各種試劑量。

n =陰性對照數(shù)（1T）+陽性對照數(shù)（1T）+誤差預(yù)留量（1T）+樣本數(shù)

（3）在無菌離心管中加入上述試劑,，充分混勻后瞬時離心。按照20 μL/管分裝量將試劑分裝至PCR反應(yīng)管,。

2.樣本準備（樣本處理區(qū)）

用DNA/RNA提取試劑盒提取核酸即可,，具體操作按照其試劑盒說明書操作。

3.加樣

在上述制備好的PCR反應(yīng)樣本管中分別加入處理好的待測標本DNA各5 μl,、終體積25 μl/管,，蓋好PCR反應(yīng)蓋混勻后瞬時低速離心，轉(zhuǎn)移到PCR儀器上,。陰性對照和陽性對照管則各加5 μL試劑盒自帶的陰性對照或陽性對照品,，終體積為25 μl/管，蓋好PCR反應(yīng)蓋混勻后瞬時低速離心,，轉(zhuǎn)移到PCR儀器上,。

4. PCR（PCR擴增區(qū)）

（1）取樣本處理區(qū)準備好的PCR反應(yīng)管，放置在實時熒光定量PCR儀樣品槽相應(yīng)位置,，并記錄放置順序,。

（2）按下表設(shè)置儀器核酸擴增相關(guān)參數(shù)進行PCR擴增。

注：ABI系列熒光PCR儀在設(shè)置時不選ROX校正,，設(shè)置淬滅基團選擇None,。

【參考值（參考范圍）】

1.試劑盒有效性判定：

（1）陽性對照：有典型S型擴增曲線或Ct值≤35。

（2）陰性對照：Ct值＞38或無Ct值,，線形為直線或輕微斜線,，無指數(shù)增長期。

2.標本結(jié)果判定：

（1）陽性：標本檢測結(jié)果Ct值≤35或有明顯指數(shù)增長期,。

（2）可疑：標本檢測結(jié)果Ct值在35～38范圍內(nèi),。此時應(yīng)對標本進行重復(fù)檢測，如重復(fù)實驗結(jié)果Ct值仍在35～38范圍內(nèi),，有明顯指數(shù)增長期,，則判定為陽性，否則為陰性,。

（3）陰性：標本檢測結(jié)果Ct值＞38或無Ct值,。

【檢驗結(jié)果的解釋】

【檢驗方法的局限性】

1. 當檢測樣本中被檢核酸濃度低于本試劑盒的最di檢出限shi可能會發(fā)生假陰性的結(jié)果,。

2. 被檢樣本在采集、運輸,、儲存以及處理過程中操作方式不當容易造成DNA降解而產(chǎn)生假陰性結(jié)果,。

3. 樣本在采集、運輸,、儲存以及處理過程中發(fā)生交叉污染,，則容易得到假陽性結(jié)果。

【產(chǎn)品性能指標】 產(chǎn)品的最di檢出限為10³ Copies/mL,，產(chǎn)品CV值≤3%,。

【注意事項】

1. 使用本試劑盒的實驗室，應(yīng)嚴格按照國家有關(guān)部分頒布的有關(guān)基因擴增檢驗實驗室管理規(guī)范進行管理,；

2. 為避免RNA降解,，樣本處理過程應(yīng)在0-4℃條件下操作，且完成實驗后立即上機檢測,；樣本處理過程中使用的器具耗材應(yīng)經(jīng)過無核酶處理,；

3. 各區(qū)域物品均為專用，不得交叉使用,，以免污染,；檢測結(jié)束后，應(yīng)立即對工作臺清潔,；

4. 吸取反應(yīng)液時,，應(yīng)盡量避免產(chǎn)生氣泡；上 PCR 儀前,，應(yīng)注意檢查各反應(yīng)管是否蓋緊,，以免液體蒸發(fā)造成結(jié)果不準確；

5. 試劑盒所有試劑在使用前應(yīng)該在常溫下充分融化混勻,，并應(yīng)瞬時離心,；

6. 試劑盒內(nèi)所配陰性和陽性對照在第一次使用前應(yīng)全部轉(zhuǎn)移至標本準備區(qū)，并單獨存放,；

7. 為防止熒光干擾,，應(yīng)避免裸手直接接觸PCR反應(yīng)管，并應(yīng)避免在PCR反應(yīng)管上進行任何標記,；

8. 檢測過程中使用過的吸頭,，應(yīng)直接打到盛有 10%次氯酸的廢物缸內(nèi)，檢測結(jié)束的PCR 反應(yīng)管,，切忌開蓋,，并與其他廢棄物品一同滅菌后丟棄；工作臺及各種實驗用品應(yīng)定期用 10%次氯酸,、75%酒精或紫外燈進行消毒,；

9. 儀器擴增相關(guān)參數(shù)應(yīng)按照本說明書相關(guān)要求進行設(shè)置,；不同批號試劑不能混用；并在有效期內(nèi)使用,。