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氧化高密度脂蛋白對(duì)單核細(xì)胞膜脂流動(dòng)性及淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原-1表達(dá)的影響
摘 要］ 目的：研究氧化高密度脂蛋白（oxHDL）對(duì)單核細(xì)胞膜脂流動(dòng)性及淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原-1（LFA-1）表達(dá)的影響,。方法：采用熒光探針DPH檢測(cè)膜脂流動(dòng)性，用流式細(xì)胞術(shù)間接免疫熒光法檢測(cè)人單核細(xì)胞株THP-1細(xì)胞表面LFA-1的表達(dá)水平,。結(jié)果：100 μg protein/mL的oxHDL和oxLDL（氧化低密度脂蛋白）作用20 h后可顯著降低THP-1細(xì)胞膜脂流動(dòng)性（LFU）,，分別較對(duì)照組低45%和52%（P＜0.01）,；oxHDL作用24 h可明顯促進(jìn)LFA-1的表達(dá)，陽(yáng)性細(xì)胞率和平均熒光強(qiáng)度分別較對(duì)照組高39%和45%（P＜0.01）,。結(jié)論：oxHDL可能通過(guò)促進(jìn)單核細(xì)胞表達(dá)LFA-1而使更多的單核細(xì)胞粘附于內(nèi)皮,，它還可降低單核細(xì)胞膜脂流動(dòng)性，這將使單核細(xì)胞在進(jìn)入內(nèi)皮下層后難于重新返回循環(huán)血中,，從而促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生,。
Effects of oxidized high-density lipoprotein on membrane fluidity
and the expression of lymphocyte function associated antigen-1 of monocyte
HU Hou-yuan, CHEN Yun-zhen
（Department of Cardiology, The First Affiliated Hospital, Chongqing Medical University, Chongqing 400016, China）
?。跘bstract］ AIM: To investigate the effects of oxidized high-density lipoprotein （oxHDL） on membrane fluidity and the expression of lymphocyte function associated antigen（LFA-1） of monocyte. METHODS: The membrane fluidity of THP-1 cells was assayed by fluorescence anisotropy with DPH （1,6-dipheny-1,3,5-hexatriene）, a fluorescent probe; The LFA-1 expression on THP-1 cells were assayed by flow cytometry with indirect immunofluorescence.RESULTS: The membrane fluidity of THP-1 cells was reduced by 45% and 52% respectively （P＜0.01） after incubation with 100 μg protein/mL oxHDL and oxLDL for 20 h; oxHDL could stimulated the expression of LFA-1 on THP-1 cells, the positive cell rate and mean fluoresence intensity （MFI） increased by 39% and 45% respectively versus control group （P＜0.01） after incubation with cells for 24 h. CONCLUSIONS: By increasing the expression of LFA-1 on monocyte, oxHDL can promote the monocyte-endothelium adhesion; oxHDL also can reduce the membrane fluidity of monocyte, that will limit the returning of monocytes from subendothelium back to the circulation. This suggested that oxHDL may play an important role in atherogenesis.
?。跰eSH］ Lipoproteins, HDL; Monocytes; Membrane fluidity; Lymphocyte function-associated antigen-1
近年研究表明，高密度脂蛋白（high density lipoprotein, HDL）也易被氧化修飾而形成氧化高密度脂蛋白（oxidized high density lipoprotein, oxHDL）,oxHDL不僅轉(zhuǎn)運(yùn)膽固醇的能力下降,，而且具有細(xì)胞毒性作用,，還可刺激內(nèi)皮細(xì)胞釋放內(nèi)皮素-1，并可被清道夫受體識(shí)別和攝取,，從而有可能促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生［1～4］,。本文進(jìn)一步研究oxHDL對(duì)人單核細(xì)胞株THP-1細(xì)胞膜脂流動(dòng)性及淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原-1（lymphocyte function-associated antigen-1,LFA-1）表達(dá)的影響，以深入探討oxHDL在動(dòng)脈粥樣硬化早期發(fā)生中的作用,。
材 料 和 方 法
一,、細(xì)胞培養(yǎng)
THP-1細(xì)胞由*上海細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫(kù)提供。采用含10%小牛血清的RPMI 1640*培養(yǎng)基（含L-谷氨酰胺2 mmol/L,、Hepes 10 mmol/L,、青鏈霉素各100 U/mL），37℃,、5%CO2孵箱中培養(yǎng),。實(shí)驗(yàn)均采用復(fù)蘇后傳至第5代以上的細(xì)胞。
二,、脂蛋白的分離和氧化修飾
采用一次性密度梯度超速離心法分離人血漿HDL（包括HDL2和HDL3）和LDL,，氧化修飾采用Cu2＋介導(dǎo)法［1］，每0.5 mg protein/mL的HDL和LDL分別與10和15 μmol/L的CuSO4于37℃,、5% CO2潮濕孵箱中共同孵育24 h,，然后以20倍體積的10 mmol/L PBS（pH 7.4）透析24 h以上，每8 h換液1次,，以去除Cu2＋和可溶性的過(guò)氧化產(chǎn)物,。硫代*酸反應(yīng)產(chǎn)物熒光檢測(cè)法測(cè)定HDL氧化前后丙二醛的含量分別為0.18和8.14 nmol/mg protein, LDL氧化前后丙二醛的含量分別為2.10和14.35 nmol/mg protein。
三,、試劑
DPH（1,，6-二苯基-1，3，5-己三烯,；1,，6-dipheny-1,3,5-hexatriene）為Fluka公司產(chǎn)品；小鼠抗人LFA-1單克隆抗體為DAKO公司產(chǎn)品,；FITC—羊抗鼠IgG抗體（GAM-FITC Ab）購(gòu)自北京中山公司,。
四、膜脂流動(dòng)性的檢測(cè)［5］
用含5%小牛血清的RPMI 1640*培養(yǎng)基調(diào)THP-1細(xì)胞至1×106／mL,，接種于24孔板中（1 mL/孔）,，加入終濃度為100 μg蛋白/mL的脂蛋白（HDL、oxHDL,、LDL和oxLDL）,，對(duì)照組加入等體積的PBS，每組設(shè)2個(gè)復(fù)孔,，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,。20 h后收集細(xì)胞，用含鈣鎂的PBS液洗2次,，調(diào)細(xì)胞密度為1×106/mL,；另取一塑料試管，加入PBS 1 mL和20 mmol/L DPH（四氫呋喃配制）5 μL,，充分振蕩5 min，再加入1 mL細(xì)胞懸液,，輕輕搖勻,，DPH終濃度為50 μmol/L，置25℃水浴30 min,，PBS洗兩次,，低速離心10 min，溶于1.5 mL PBS中,，室溫下測(cè)熒光強(qiáng)度（I）,，激發(fā)波長(zhǎng)360 nm，發(fā)射波長(zhǎng)430 nm,，狹縫10 nm,。按下列公式計(jì)算偏振度（P）、微粘度（η）和膜脂流動(dòng)性（LFU）：
P=（Ivv-gIvh）/（Ivv+gIvh）
其中g(shù)為校正因子,，按下式計(jì)算：g=Ihv/Ihh,；P為偏振度，I為熒光強(qiáng)度,；v代表垂直方向,，h代表水平方向，I的一對(duì)限定因素中，*個(gè)為起偏器光軸的方向,，第二個(gè)為檢偏器光軸的方向,。
η=2P/（0.46-P）
式中的η為微粘度，0.46為常數(shù),。
LFU=［（Pzui大值/Pr）-1］÷Pr
式中LFU為膜脂流動(dòng)性,，Pzui大值為0.5，Pr為P的實(shí)測(cè)值,。
五,、LFA-1表達(dá)的檢測(cè)
THP-1細(xì)胞以含10%小牛血清的RPMI 1640*培養(yǎng)基調(diào)至1×106/mL，接種于24孔板中（1 mL/孔）,，分為對(duì)照組（加入等體積的PBS）,、HDL組和oxHDL組，脂蛋白作用時(shí)間為24 h,，實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次,。采用流式細(xì)胞術(shù)間接免疫熒光法檢測(cè)LFA-1的表達(dá)，主要步驟如下：取5×105細(xì)胞,，用冷PBA（10 mmol/L PBS,，含0.1%BSA，0.1%NaN3,，pH7.4）清洗兩遍,，棄上清，加入以PBA 1∶100稀釋的單克隆抗體100 μL（背景對(duì)照組只加不含單抗的PBA）,，輕輕吹打混勻,，4℃放置30 min，PBA洗2次,，再加入以1∶15稀釋的GAM-FITC Ab 100 μL,，輕輕吹打混勻，4℃ 30 min,，離心棄上清,，用冷PBA洗3次，zui后用0.5 mL PBS懸起細(xì)胞,，用FACStar-PLUS流式細(xì)胞儀檢測(cè),，以背景對(duì)照為基礎(chǔ)計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞率（%）和平均熒光強(qiáng)度（MFI）。
五,、統(tǒng)計(jì)處理
數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ ±s）表示,，差異顯著性以t檢驗(yàn)判定。
結(jié) 果
一,、oxHDL和oxLDL對(duì)THP-1細(xì)胞膜脂流動(dòng)性的影響
oxHDL和oxLDL可明顯降低THP-1細(xì)胞的膜脂流動(dòng)性（LFU）,，100 μg protein/mL的oxHDL和oxLDL作用20 h后THP-1細(xì)胞的LFU分別較對(duì)照組低45%和52%（P＜0.01）,；而HDL和LDL對(duì)膜脂流動(dòng)性無(wú)明顯影響（見(jiàn)表1）。
表1 HDLs和LDLs對(duì)THP-1細(xì)胞膜脂流動(dòng)性的影響
Tab 1 Effexts of HDLs and LDLs on membrane lipid fluidity of THP-1 cells （ ±s,n=6）
| | Control | HDL | oxHDL | LDL | oxLDL |
| P | 0.145±0.021 | 0.155±0.019 | 0.180±0.009*＃ | 0.151±0.029 | 0.191±0.010* *＃＃ |
| η | 0.928±0.188 | 1.012±0.176 | 1.287±0.045*＃ | 0.992±0.285 | 1.433±0.121* *＃＃ |
| LFU | 17.970±6.140 | 15.170±4.940 | 9.930±0.690*＃ | 16.920±6.470 | 8.570±0.820*＃ |
*P＜0.05, * * P＜0.01,， vs control group; ?！＜0.05, ＃＃ P＜0.01,， vs unmodified group of each 二,、oxHDL對(duì)THP-1細(xì)胞LFA-1表達(dá)的影響
oxHDL可明顯促進(jìn)THP-1細(xì)胞LFA-1的表達(dá)， 100 μg protein/mL的oxHDL作用24 h后其LFA-1的陽(yáng)性細(xì)胞率和平均熒光強(qiáng)度分別較對(duì)照組高39%和45%（P＜0.01）,；而HDL無(wú)此作用（見(jiàn)表2）,。
表2 HDLs對(duì)THP-1細(xì)胞LFA-1表達(dá)的陽(yáng)性細(xì)胞率
和平均熒光強(qiáng)度的影響
Tab 2 Positive rate and MFI of LFA-1 on THP-1 cells in
response to HDLs （ ±s,n=4）
| | Control | HDL | oxHDL | |
| % | 43.3±3.7 | 45.2±4.5 | 60.1±2.5* *＃＃ | |
| MFI | 132.8±18.7 | 138.3±20.5 | 191.5±17.6* *＃＃ | |
* *P＜0.01，vs control group; ＃?！＜0.01,， vs HDL group; mFI: mean fluoresence intensity討 論
THP-1細(xì)胞是一種人單核細(xì)胞株，建株于一急性單核細(xì)胞白血病患兒,，具備人單核細(xì)胞絕大多數(shù)的生物學(xué)功能和生化功能特征,。與人單核細(xì)胞相比，THP-1細(xì)胞更容易獲得,、并能傳代培養(yǎng),，經(jīng)佛波酯刺激后可轉(zhuǎn)變?yōu)榫奘杉?xì)胞，吞噬脂質(zhì)后可進(jìn)一步演變成泡沫細(xì)胞,，因此被廣泛用于有關(guān)動(dòng)脈粥樣硬化方面的研究［6］,。
本研究進(jìn)一步探討了oxHDL對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生中的重要細(xì)胞成分—單核細(xì)胞—的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn),，oxHDL和oxLDL可降低THP-1細(xì)胞的膜脂流動(dòng)性（LFU）,，與對(duì)照組相比分別低45%和53%，而HDL和LDL對(duì)膜脂流動(dòng)性無(wú)明顯影響,。已有研究表明，oxLDL可降低內(nèi)皮細(xì)胞膜脂流動(dòng)性,，其機(jī)制可能為：①氧化脂蛋白可被細(xì)胞膜上的受體攝取,，從而使細(xì)胞膜中膽固醇酯的含量增加；②氧化脂蛋白導(dǎo)致的細(xì)胞內(nèi)鈣濃度增加,，可使膜收縮蛋白發(fā)生交聯(lián)［7,，8］。氧化脂蛋白使單核細(xì)胞膜脂流動(dòng)性的降低,，將使單核細(xì)胞在進(jìn)入內(nèi)膜后更難于返回循環(huán)血中,，從而使更多的單核細(xì)胞向巨噬細(xì)胞和泡沫細(xì)胞轉(zhuǎn)化。
LFA-1主要位于白細(xì)胞的表面,，是細(xì)胞間粘附分子ICAM-1和ICAM-2的受體,，在單核細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的粘附中發(fā)揮重要作用,。本研究表明oxHDL可明顯促進(jìn)THP-1細(xì)胞LFA-1的表達(dá)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示oxHDL作用24 h后其陽(yáng)性細(xì)胞率和平均熒光強(qiáng)度分別較對(duì)照組高39%和45%,，而HDL無(wú)此作用,。
本研究表明，oxHDL可通過(guò)促進(jìn)單核細(xì)胞表達(dá)LFA-1而使更多的單核細(xì)胞粘附于內(nèi)皮,，它還可降低單核細(xì)胞膜脂流動(dòng)性,，這將使單核細(xì)胞在進(jìn)入內(nèi)皮下層后難于重新返回循環(huán)血中，從而促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生,。本研究還提示,，通過(guò)防止各種因素對(duì)脂蛋白的氧化將會(huì)在一定程度上預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生。關(guān)于oxHDL的體內(nèi)存在形式以及是否具有更廣泛的致動(dòng)脈粥樣硬化作用尚有待進(jìn)一步研究,。
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