在 CRISPR-Cas9 基因編輯技術(shù)中常用的分子生物學(xué)試劑有哪些?
在 CRISPR-Cas9 基因編輯技術(shù)中,,常用的分子生物學(xué)試劑按實(shí)驗(yàn)流程可分為載體構(gòu)建、gRNA 制備,、細(xì)胞遞送,、編輯檢測(cè)、篩選與修復(fù)五大核心環(huán)節(jié),,以下是常用到的生物試劑:
一,、載體構(gòu)建階段
1. 限制性內(nèi)切酶
作用:切割質(zhì)粒載體和目的 DNA 片段,用于 gRNA 表達(dá)盒或 Cas9 表達(dá)載體的組裝,。
常用酶:
BsaI:識(shí)別非常規(guī)回文序列(如 GGTCTC),切割后產(chǎn)生黏性末端,,適用于 Golden Gate 克隆法,,批量組裝 gRNA 表達(dá)單元(尤其適用于 CRISPR 文庫(kù)構(gòu)建)。
EcoRI,、HindIII:傳統(tǒng)限制性內(nèi)切酶,,比如百時(shí)美的EG15536S常用于質(zhì)粒線性化(如 pUC19、pSpCas9 載體),。
AgeI,、AscI:稀有切點(diǎn)酶,減少載體內(nèi)部酶切位點(diǎn)干擾,,提高克隆效率,。
應(yīng)用場(chǎng)景:載體酶切→目的片段插入→連接反應(yīng)(需配合 T4 DNA 連接酶)。
2. DNA 連接酶
T4 DNA 連接酶:連接酶切后的載體與 gRNA 片段,,形成重組質(zhì)粒,。
Gibson 組裝試劑盒:基于同源重組的無(wú)縫克隆技術(shù),無(wú)需酶切位點(diǎn),,直接拼接多個(gè) DNA 片段(如 Cas9 表達(dá)盒與 gRNA 陣列),。
3. 質(zhì)粒提取與純化試劑
質(zhì)粒小提試劑盒(如 Qiagen Miniprep):從大腸桿菌中提取重組質(zhì)粒,用于后續(xù)轉(zhuǎn)染或測(cè)序驗(yàn)證,。
二,、gRNA 設(shè)計(jì)與制備
1. gRNA 寡核苷酸合成
DNA 寡核苷酸:合成 gRNA 的 crRNA(靶向序列)和 tracrRNA 互補(bǔ)鏈,,通常含 20nt 靶向序列 + PAM 鄰近序列(如 NGG)。
磷酸化試劑:如 T4 多核苷酸激酶(PNK),,對(duì)寡核苷酸 5' 端磷酸化,,提高連接效率。
2. 體外轉(zhuǎn)錄(IVT)試劑
RNA 聚合酶:如 T7 RNA 聚合酶,,以 DNA 為模板轉(zhuǎn)錄 gRNA(需含 T7 啟動(dòng)子序列),,適用于體外合成 sgRNA(單鏈 gRNA)。
RNA 純化試劑盒(如 RNA Clean & Concentrator):去除轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中的 DNA 模板和雜質(zhì),,獲得高純度 sgRNA,。
3. 引物與 PCR 試劑
PCR 引物:擴(kuò)增 gRNA 表達(dá)盒(如 U6 啟動(dòng)子 + gRNA 序列),或用于載體構(gòu)建中的序列驗(yàn)證(如菌落 PCR),。
高保真 DNA 聚合酶(如 Q5,、KOD):確保擴(kuò)增序列無(wú)突變,尤其在構(gòu)建 CRISPR 文庫(kù)時(shí)避免靶向誤差,。
實(shí)驗(yàn)流程 | 核心模塊 | 關(guān)鍵試劑 / 技術(shù) | 具體功能與應(yīng)用場(chǎng)景 | 可視化標(biāo)簽 |
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載體構(gòu)建 | 限制性內(nèi)切酶 | BsaI,、EcoRI、AgeI,、AscI | - BsaI:Golden Gate 克隆法,,批量組裝 gRNA 表達(dá)單元(適用于 CRISPR 文庫(kù)) - 稀有酶(AgeI/AscI):減少載體內(nèi)部酶切干擾 | ?? 酶切工具 |
DNA 連接與組裝 | T4 DNA 連接酶、Gibson 組裝試劑盒 | - T4 連接酶:黏性末端連接載體與目的片段 - Gibson 組裝:無(wú)縫克?。o(wú)需酶切位點(diǎn),,拼接多片段如 Cas9+gRNA 陣列) | ?? 連接工具 | |
質(zhì)粒操作 | 質(zhì)粒小提試劑盒、Q5 高保真聚合酶 | - 提取重組質(zhì)粒(Qiagen Miniprep) - 菌落 PCR 驗(yàn)證(高保真酶確保無(wú)突變,,尤其文庫(kù)構(gòu)建) | ?? 質(zhì)粒工程 | |
gRNA 制備 | 序列設(shè)計(jì) | 20nt 靶向寡核苷酸(含 PAM),、T4 PNK 激酶 | - 合成 crRNA/tracrRNA 互補(bǔ)鏈,5' 端磷酸化提高連接效率 - 靶向序列需避開(kāi)脫靶位點(diǎn)(如使用 E-CRISP 數(shù)據(jù)庫(kù)設(shè)計(jì)) | ?? 靶向序列設(shè)計(jì) |
合成技術(shù) | IVT 試劑盒(T7 聚合酶),、PAGE 純化 sgRNA | - 體外轉(zhuǎn)錄:T7 聚合酶 + DNA 模板(含 T7 啟動(dòng)子)合成 sgRNA - 化學(xué)合成:高純度 sgRNA(適用于 RNP 復(fù)合物遞送) | ?? RNA 合成 | |
細(xì)胞遞送 | 體外遞送 | 脂質(zhì)體(Lipofectamine 3000),、電轉(zhuǎn)染試劑 | - 脂質(zhì)體:貼壁細(xì)胞(HEK293T/HeLa)高效轉(zhuǎn)染 - 電轉(zhuǎn)儀:原代細(xì)胞 / 難轉(zhuǎn)染細(xì)胞(如 T 細(xì)胞、干細(xì)胞) | ?? 體外遞送 |
體內(nèi)遞送 | 慢病毒 / AAV 載體系統(tǒng),、輔助包裝質(zhì)粒 | - 慢病毒:感染分裂 / 非分裂細(xì)胞(如神經(jīng)元),,穩(wěn)定整合 - AAV:肝臟 / 肌肉靶向(SaCas9 因體積小適合 AAV 包裝) | ?? 病毒載體 | |
蛋白遞送 | 重組 Cas9 蛋白(如 SpCas9-NLS)、RNP 復(fù)合物 | - 核定位信號(hào)修飾 Cas9,,與 sgRNA 組裝成 RNP - 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染降低脫靶(避免質(zhì)粒整合風(fēng)險(xiǎn),,適用于原代細(xì)胞) | ?? 蛋白復(fù)合體 | |
編輯檢測(cè) | 分子水平驗(yàn)證 | T7E1 酶 / Surveyor 核酸酶、Sanger/NGS 測(cè)序 | - 酶切錯(cuò)配 DNA 檢測(cè) Indels(凝膠電泳初步篩選) - 高通量測(cè)序定量脫靶率(如 Illumina TruSeq 建庫(kù)) | ?? 突變檢測(cè) |
細(xì)胞水平分析 | 熒光報(bào)告載體(GFP/mCherry),、FACS 分選 | - 報(bào)告載體:評(píng)估基因敲除 / 激活效率(如破壞 GFP 開(kāi)放閱讀框) - 流式分選:富集陽(yáng)性編輯細(xì)胞(無(wú)抗生素篩選場(chǎng)景) | ?? 細(xì)胞篩選 | |
篩選與修復(fù) | 陽(yáng)性克隆篩選 | 抗生素(Puro/G418),、抗性基因載體 | - 穩(wěn)定細(xì)胞系構(gòu)建:載體攜帶抗性基因,抗生素篩選單克隆 - 配合有限稀釋法獲得純合敲除細(xì)胞 | ?? 篩選標(biāo)記 |
精準(zhǔn)修復(fù)(HDR) | ssODN(同源臂 100-200nt),、雙鏈 DNA 供體質(zhì)粒 | - ssODN:點(diǎn)突變修復(fù)或小片段插入(化學(xué)合成,,PAGE 純化) - 雙鏈質(zhì)粒:大片段基因敲入(如熒光蛋白基因) | ? 同源修復(fù)模板 | |
堿基編輯 | BE3/ABE 系統(tǒng)(脫氨酶 + Cas9n),、UGI 抑制劑 | - BE3:C→T 單堿基編輯(需 UGI 保護(hù)尿嘧啶不被修復(fù)) - ABE:A→G 編輯(TadA 脫氨酶變體,無(wú) DSB 風(fēng)險(xiǎn)) | ?? 單堿基編輯工具 | |
輔助系統(tǒng) | 細(xì)胞培養(yǎng)優(yōu)化 | ROCK 抑制劑(Y-27632),、干細(xì)胞培養(yǎng)基 | - 提高干細(xì)胞轉(zhuǎn)染后存活率 - 無(wú)血清培養(yǎng)基維持原代細(xì)胞狀態(tài) | ?? 細(xì)胞培養(yǎng)支持 |
高通量篩選 | CRISPR 文庫(kù)(GeCKO/Achilles),、慢病毒包裝 | - 全基因組 gRNA 文庫(kù)篩選關(guān)鍵基因(如癌癥耐藥基因) - 配合 NGS 分析富集 / 耗竭靶點(diǎn) | ?? 功能基因組篩選 |
三、細(xì)胞遞送與編輯
1. 轉(zhuǎn)染試劑
脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑:如 Lipofectamine 3000,、JetPrime,,將重組質(zhì)粒或 sgRNA/Cas9 核糖核蛋白(RNP)復(fù)合物導(dǎo)入細(xì)胞(適用于貼壁細(xì)胞,,如 HEK293T,、HeLa)。
電轉(zhuǎn)染試劑盒:如 Nucleofector 電轉(zhuǎn)儀配套試劑,,適用于難轉(zhuǎn)染細(xì)胞(原代細(xì)胞,、免疫細(xì)胞)。
病毒包裝試劑:
慢病毒包裝質(zhì)粒(psPAX2,、pMD2.G):包裝 Cas9/gRNA 載體,,感染分裂或非分裂細(xì)胞(如神經(jīng)元)。
AAV 載體系統(tǒng):含 AAV 反向末端重復(fù)序列(ITR),、Cas9 基因,,用于體內(nèi)遞送(需輔助質(zhì)粒 pAAV-RC、pAAV Helper),。
2. Cas9 蛋白與 RNP 復(fù)合物
重組 Cas9 蛋白:如 SpCas9-NLS(核定位信號(hào)修飾),,與 sgRNA 體外組裝成 RNP,瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞以降低脫靶風(fēng)險(xiǎn)(避免質(zhì)粒整合),。
蛋白酶抑制劑:如 PMSF,在蛋白純化過(guò)程中保護(hù) Cas9 不被降解,。
四,、編輯效率檢測(cè)
1. PCR 與測(cè)序試劑
Taq PCR 試劑盒:擴(kuò)增編輯位點(diǎn)上下游 DNA,用于 Sanger 測(cè)序(檢測(cè) Indels)或 TA 克隆后測(cè)序(分析突變頻率),。
高通量測(cè)序建庫(kù)試劑:如 Illumina TruSeq DNA Kit,,對(duì)大量樣本進(jìn)行深度測(cè)序,定量脫靶效應(yīng),。
2. 錯(cuò)配切割酶
T7E1 核酸酶/ Surveyor 核酸酶:識(shí)別編輯后 DNA 雙鏈錯(cuò)配位點(diǎn)并切割,,通過(guò)凝膠電泳檢測(cè)突變效率(適用于初步篩選)。
3. 熒光定量試劑
qPCR 試劑盒:檢測(cè)報(bào)告基因(如 GFP)的表達(dá)變化,,評(píng)估基因敲除 / 激活效率(需構(gòu)建熒光報(bào)告載體,,如 Cas9-dCas9 融合激活系統(tǒng))。
五,、篩選與修復(fù)過(guò)程
1. 篩選標(biāo)記試劑
抗生素:如嘌呤霉素(Puro),、G418(Neomycin),,篩選穩(wěn)定整合 Cas9/gRNA 載體的細(xì)胞克隆(需載體攜帶抗性基因),。
流式細(xì)胞儀(FACS):分選表達(dá)熒光標(biāo)記(如 mCherry)的陽(yáng)性細(xì)胞,,適用于無(wú)抗生素篩選的場(chǎng)景。
2. HDR 供體模板
單鏈寡核苷酸(ssODN):含同源臂的修復(fù)模板,,用于精確基因敲入(如點(diǎn)突變修復(fù)),,需化學(xué)合成并經(jīng) PAGE 純化。
雙鏈 DNA 質(zhì)粒:作為 HDR 供體,,攜帶大片段外源基因(如熒光蛋白基因),,需配合 Cas9 切割誘導(dǎo)同源重組。
3. 堿基編輯相關(guān)試劑
脫氨酶融合蛋白:如胞嘧啶脫氨酶(APOBEC1)或腺嘌呤脫氨酶(TadA),,與 Cas9n(切口酶)結(jié)合,,實(shí)現(xiàn)單堿基編輯(如 BE3、ABE 系統(tǒng)),,無(wú)需 DSB 即可完成 C→T 或 A→G 替換,。
尿嘧啶糖基化酶抑制劑(UGI):保護(hù)編輯過(guò)程中產(chǎn)生的尿嘧啶不被修復(fù),提高堿基編輯效率(常見(jiàn)于胞嘧啶堿基編輯器),。
六,、輔助試劑與系統(tǒng)優(yōu)化
1. 細(xì)胞培養(yǎng)試劑
培養(yǎng)基與添加劑:如 DMEM、胎牛血清(FBS),,維持細(xì)胞狀態(tài),;ROCK 抑制劑(Y-27632)提高干細(xì)胞轉(zhuǎn)染后的存活率。
細(xì)胞裂解液:如 RIPA 緩沖液,,提取細(xì)胞蛋白用于 Western blot 檢測(cè) Cas9 表達(dá),。
2. 基因編輯工具盒
CRISPR 文庫(kù)篩選試劑盒:如 Broad Institute 的 GeCKO 文庫(kù),包含靶向全基因組的 gRNA 陣列,,用于功能基因篩選(需配合慢病毒包裝試劑),。
CRISPR 激活 / 抑制系統(tǒng):dCas9-VPR(激活)或 dCas9-KRAB(抑制)質(zhì)粒,搭配 sgRNA 實(shí)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控,,需啟動(dòng)子區(qū)域靶向 gRNA,。
試劑分類與應(yīng)用流程圖
實(shí)驗(yàn)流程 核心試劑 作用
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載體構(gòu)建 限制性內(nèi)切酶(BsaI、EcoRI),、T4連接酶 切割/連接gRNA/Cas9載體
gRNA制備 IVT試劑盒(T7聚合酶),、DNA寡核苷酸 合成sgRNA
細(xì)胞遞送 轉(zhuǎn)染試劑(脂質(zhì)體/電轉(zhuǎn))、病毒包裝質(zhì)粒 導(dǎo)入細(xì)胞/體內(nèi)遞送
編輯檢測(cè) T7E1酶,、PCR試劑,、測(cè)序試劑盒 評(píng)估突變效率與脫靶
篩選修復(fù) 抗生素、ssODN供體、堿基編輯器組分 篩選陽(yáng)性細(xì)胞/精確修復(fù)
輔助優(yōu)化 細(xì)胞培養(yǎng)基,、CRISPR文庫(kù),、蛋白酶抑制劑 系統(tǒng)優(yōu)化與功能擴(kuò)展
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實(shí)驗(yàn)試劑選擇策略與注意事項(xiàng):
遞送效率:原代細(xì)胞先選電轉(zhuǎn)或病毒載體,貼壁細(xì)胞可用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染,。
檢測(cè)精度需求:初步篩選用 T7E1 酶,,精準(zhǔn)分析需高通量測(cè)序。
修復(fù)類型選擇:基因敲除依賴 NHEJ(無(wú)需供體),,精確編輯需 HDR(需 ssODN/dsDNA 供體),。
安全性考量:RNP 復(fù)合物(蛋白 + sgRNA)可減少質(zhì)粒整合風(fēng)險(xiǎn),適用于醫(yī)學(xué)研究,。
蘇州阿爾法生物作為百時(shí)美的聯(lián)盟供應(yīng)商提供實(shí)驗(yàn)室儀器設(shè)備,, 實(shí)驗(yàn)耗材,生物試劑的一站式服務(wù),,所提供的分子生物學(xué)試劑主要包括:限制性內(nèi)切酶 ,,taq聚合酶,逆轉(zhuǎn)試劑盒,,熒光定量試劑,、體外轉(zhuǎn)錄酶等。
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