一,、實(shí)驗(yàn)原理

細(xì)胞凍存隨著溫度降低,，細(xì)胞內(nèi)的酶活性會(huì)逐漸降低,，到-80℃左右,，酶活性幾乎為0,，代謝活動(dòng)停止,，可以實(shí)現(xiàn)長期保存,。然而,，隨著溫度降低，細(xì)胞內(nèi)外的水分也會(huì)“結(jié)冰”并形成冰晶,，冰晶能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)發(fā)生機(jī)械損傷,、電解質(zhì)升高、滲透壓改變,、脫水,、pH改變、蛋白變性等,，能引起細(xì)胞死亡,。因此常加入冷凍保護(hù)劑甘油或二甲基亞砜（DMSO）。DMSO能快速穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞,，降低冰點(diǎn),，延緩凍存過程，同時(shí)增加細(xì)胞膜的通透性,，提高細(xì)胞內(nèi)離子濃度,，減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成，從而達(dá)到保護(hù)細(xì)胞的目的,。

二,、實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備

1.細(xì)胞：選擇處于對數(shù)生長期（一般密度為80%-95%，不要使細(xì)胞長得過密）,、狀態(tài)良好且無污染的細(xì)胞進(jìn)行凍存,。在凍存前一天，更換新鮮的全培養(yǎng)基,，確保細(xì)胞處于最佳生長狀態(tài),。

2.培養(yǎng)基：準(zhǔn)備適量的細(xì)胞培養(yǎng)所用的全培養(yǎng)基,，根據(jù)細(xì)胞類型確定其配方，如 RPMI-1640,、DMEM 等,，并添加10%的胎牛血清（FBS），根據(jù)細(xì)胞不同,，血清濃度可能會(huì)有變化,，具體以培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)需要的血清濃度為準(zhǔn)。

3.凍存液：

（1）一般使用含有 90% 全培養(yǎng)基 和 10% 二甲基亞砜（DMSO）的凍存液,。DMSO 需提前預(yù)冷至 4℃以下,，且要確保其質(zhì)量和純度，避免對細(xì)胞造成損傷,。將凍存液在冰上或 4℃冰箱中配制,，輕輕混勻。

（2）使用商品化的細(xì)胞凍存液,，凍存液使用前保存在4℃冰箱。

4.凍存管：選用無菌,、無 DNase 和 RNase,、耐低溫的凍存管。在凍存管上清晰標(biāo)記細(xì)胞名稱,、凍存日期,、細(xì)胞代數(shù)等重要信息，以便后續(xù)識別和使用,。

5.水平離心機(jī)：確保離心機(jī)的轉(zhuǎn)速和離心力準(zhǔn)確可靠,，能夠達(dá)到 1000 - 1500 rpm 的轉(zhuǎn)速，用于細(xì)胞沉淀收集,。提前清潔和消毒離心機(jī)轉(zhuǎn)頭及離心管套筒,，防止交叉污染。

6.其他耗材：準(zhǔn)備無菌的移液槍及配套槍頭,，不同量程的移液槍應(yīng)經(jīng)過校準(zhǔn)且在有效期內(nèi),。槍頭需為無菌、無熱原的一次性耗材,，避免對細(xì)胞產(chǎn)生污染,。同時(shí)，準(zhǔn)備適量的 PBS 緩沖液用于細(xì)胞洗滌,，PBS 緩沖液需提前預(yù)熱至 37℃,。

三、操作步驟

1. 細(xì)胞收集：

1）.以T25瓶為例,，在超凈工作臺中,，先將培養(yǎng)瓶中的舊培養(yǎng)基輕輕吸出,，用預(yù)熱至 37℃的 PBS 緩沖液緩慢沖洗細(xì)胞 2 - 3 次，每次沖洗時(shí) PBS 緩沖液的用量以能覆蓋細(xì)胞單層為宜,，一般為 5 - 10 ml,。沖洗的目的是去除殘留的培養(yǎng)基和血清，減少其對后續(xù)凍存過程的影響,。

2）.然后加入適量的胰酶-EDTA 溶液（根據(jù)細(xì)胞類型和培養(yǎng)瓶大小確定用量,，一般 T25培養(yǎng)瓶加入1 ml）

3）.將培養(yǎng)瓶置于 37℃培養(yǎng)箱中消化 1 - 5 分鐘。在消化過程中,，需密切觀察細(xì)胞形態(tài)變化,。當(dāng)細(xì)胞開始變圓、收縮并逐漸從培養(yǎng)容器底部脫離時(shí),，用手輕輕拍打培養(yǎng)容器的側(cè)壁,，幫助細(xì)胞全脫落。不同細(xì)胞類型的消化時(shí)間會(huì)有所不同,，例如,，一些上皮細(xì)胞可能需要3-5分鐘左右，而一些成纖維細(xì)胞可能需要2-4分鐘左右,。

4）.用移液槍輕輕吹打細(xì)胞懸液,，使細(xì)胞充分脫離培養(yǎng)瓶底部并分散均勻，避免產(chǎn)生過多氣泡,。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至15 ml離心管中,。

2. 細(xì)胞計(jì)數(shù)與離心：

1).取少量細(xì)胞懸液，使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板或細(xì)胞計(jì)數(shù)儀進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),，計(jì)算細(xì)胞濃度和活率,。

2).根據(jù)細(xì)胞濃度、活率和所需凍存的細(xì)胞數(shù)量,，調(diào)整細(xì)胞懸液體積,；一般凍細(xì)胞的密度為1×10^6 - 5×10^6個(gè)/ml。

3).將離心管放入離心機(jī)中,，設(shè)置轉(zhuǎn)速為1000 rpm,，離心5分鐘。

4).離心結(jié)束后,，小心取出離心管,，將其置于超凈工作臺中，緩慢吸出上清液,，盡量避免吸到細(xì)胞沉淀,。

3. 凍存液重懸細(xì)胞：

1).根據(jù)細(xì)胞沉淀的量，加入適量預(yù)冷的凍存液,，一般按照1×10^6 - 5×10^6個(gè)/ml細(xì)胞密度進(jìn)行重懸,。

2).用移液槍輕輕吹打細(xì)胞沉淀,，使細(xì)胞均勻分散在凍存液中，確保細(xì)胞密度適中,，避免細(xì)胞團(tuán)聚,。

3).重懸后的細(xì)胞，盡量減少細(xì)胞存放于室溫的時(shí)間,，盡快進(jìn)入凍存階段,。

4. 細(xì)胞分裝與凍存：

1).將重懸后的細(xì)胞懸液分裝至標(biāo)記好的凍存管中，每管分裝的細(xì)胞懸液體積一般為 1 - 1.5 ml,。在分裝過程中,，要注意避免產(chǎn)生氣泡，同時(shí)確保凍存管密封良好,。

2).由于使用的凍存方式不同會(huì)有不同的凍存方法,，請選擇合適的凍存步驟。

a. 使用傳統(tǒng)方法：將凍存管先放入 4℃冰箱中靜置60 分鐘,，使細(xì)胞逐漸適應(yīng)低溫環(huán)境,。然后將凍存管轉(zhuǎn)移至 -20℃冰箱中放置2小時(shí)，接著再放入-80℃冰箱過夜,。最后,，將凍存管迅速轉(zhuǎn)移至液氮罐中進(jìn)行長期保存。在轉(zhuǎn)移過程中,，要盡量縮短凍存管在室溫及 -20℃以上環(huán)境中的停留時(shí)間，防止細(xì)胞受損,。

b. 使用凍存盒：將凍存管放入4℃預(yù)冷的凍存盒（確保凍存盒已加滿或更新異丙醇）中,，然后快速將凍存管轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱過夜。最后,，將凍存管迅速轉(zhuǎn)移至液氮罐中進(jìn)行長期保存,。在轉(zhuǎn)移過程中，要盡量縮短凍存管在室溫及 -20℃以上環(huán)境中的停留時(shí)間,，防止細(xì)胞受損,。

c. 使用細(xì)胞凍存液：將凍存管轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱過夜，然后將凍存管迅速轉(zhuǎn)移至液氮罐中進(jìn)行長期保存,。在轉(zhuǎn)移過程中,，要盡量縮短凍存管在室溫及 -20℃以上環(huán)境中的停留時(shí)間，防止細(xì)胞受損,。