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干貨 | 雙熒光素酶驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子區(qū)調(diào)控作用

來源：翌圣生物科技（上海）股份有限公司 2025年03月24日 08:39

轉(zhuǎn)錄因子是一類參與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的重要調(diào)節(jié)因子,。不同轉(zhuǎn)錄因子的DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域識(shí)別不同基因啟動(dòng)子區(qū)特定的堿基序列,，行使抑制或激活該基因轉(zhuǎn)錄的功能。將目的基因啟動(dòng)子區(qū)域（通常取轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)TSS 上游-2000bp）,、或針對(duì)結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行突變,、或分段截?cái)嘈蛄校瑯?gòu)建到報(bào)告基因載體luciferase 的上游,，共轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)錄因子過表達(dá)質(zhì)粒,，通過熒光素酶活反映轉(zhuǎn)錄因子對(duì)啟動(dòng)子活性的調(diào)控作用。

圖1.轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子調(diào)控示意圖

常用載體：pGL3-Basic ,、pGL3-Promoter

圖2 .載體信息

翌圣雙熒光素酶報(bào)告基因檢測服務(wù)流程

客戶提供

翌圣服務(wù)

客戶所得

1,、待研究啟動(dòng)子基因詳細(xì)信息

2、轉(zhuǎn)錄因子詳細(xì)信息

1,、轉(zhuǎn)錄因子和啟動(dòng)子結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測

2,、方案設(shè)計(jì)、引物設(shè)計(jì)與合成

3,、序列合成,、質(zhì)粒構(gòu)建及細(xì)胞轉(zhuǎn)染

4、熒光素酶活性檢測

1,、項(xiàng)目所得質(zhì)粒及菌液

2,、中間樣品

3、完整項(xiàng)目報(bào)告

實(shí)驗(yàn)步驟

目的細(xì)胞質(zhì)粒瞬轉(zhuǎn)預(yù)實(shí)驗(yàn)

當(dāng)選擇在目的細(xì)胞（而非293 工具細(xì)胞）中進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)時(shí),，首先要確認(rèn)目的細(xì)胞的質(zhì)粒瞬轉(zhuǎn)效率,，以及摸索合適的瞬轉(zhuǎn)體系，質(zhì)粒瞬轉(zhuǎn)效率>40%以上時(shí)表明預(yù)實(shí)驗(yàn)通過,。

目的細(xì)胞質(zhì)粒瞬轉(zhuǎn)預(yù)實(shí)驗(yàn)

a. 將狀態(tài)良好,，處于對(duì)數(shù)生長期的空白細(xì)胞用0.25%胰酶消化，用wanquan培養(yǎng)基懸浮成
單細(xì)胞懸液,，細(xì)胞計(jì)數(shù)后,，接種于24 孔培養(yǎng)板中,；
b. 培養(yǎng)過夜，觀察細(xì)胞生長狀態(tài),。在細(xì)胞覆蓋率70%左右時(shí),，進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)；
c. 轉(zhuǎn)染2 h 前換液為新鮮的培養(yǎng)基,；
d. 轉(zhuǎn)染取無菌的1.5 mL EP 管,，按照轉(zhuǎn)染試劑使用說明進(jìn)行轉(zhuǎn)染復(fù)合物配置
e. 轉(zhuǎn)染48 h 后收集細(xì)胞樣品。

報(bào)告基因檢測

細(xì)胞樣品收集

a. 轉(zhuǎn)染后從培養(yǎng)箱中取靶細(xì)胞,，輕輕吸凈培養(yǎng)液,，PBS 洗滌2 次；
b. 棄去PBS,，每孔加入100μL 的1×PLB（5X Passive Lysis Buffer 用無菌水稀釋而得）,；
c. 細(xì)胞裂解后，將樣品轉(zhuǎn)移入Ep 管中,，-80 度冰箱保存,。

根據(jù)報(bào)告基因檢測試劑盒說明書操作進(jìn)行檢測

a. 將充分裂解后的裂解產(chǎn)物，10,000-15,000 rpm 離心3-5 min,。離心后將上清液移入新的EP 管進(jìn)行后續(xù)檢測,。

b. Renilla Luciferase Assay 工作液的配置：按照樣品要求的量，將Renilla Luciferase Assay Reagent(100×)按照稀釋比例加入Renilla Luciferase Assay buffer,，混勻后室溫放置,。

c. 熒光素酶檢測：

按照儀器說明書要求將熒光檢測打開，設(shè)定參數(shù),，測定時(shí)間為10 s,，測定間隔為2 s；將樣品按照20 μL 的體積加入測量管中（保持每次樣品的加樣量一致）,，另外加入20 μL Firefly Luciferase Assay Reagent 混勻2-3 次（不能漩渦混勻）,，充分混勻后測定RLU（Relative light unit），同時(shí)設(shè)置Cell Lysis buffer 為空白對(duì)照孔,；將檢測后的樣品,，加入20 μL 配制的Renilla Luciferase Assay 工作液混勻2-3 次，充分混勻后測定RLU,，同時(shí)設(shè)置Renilla Luciferase Assay 工作液為空白對(duì)照孔,。

數(shù)據(jù)處理與分析，計(jì)算相對(duì)熒光強(qiáng)度

提供原始實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與完整實(shí)驗(yàn)報(bào)告

常規(guī)檢測分組

（1）過表達(dá)對(duì)照+啟動(dòng)子對(duì)照+海腎內(nèi)參(TK)

（2）過表達(dá)對(duì)照+啟動(dòng)子野生型+海腎內(nèi)參(TK)

（3）過表達(dá)對(duì)照+啟動(dòng)子突變型+海腎內(nèi)參(TK)

（4）轉(zhuǎn)錄因子過表達(dá)+啟動(dòng)子對(duì)照+海腎內(nèi)參(TK)

（5）轉(zhuǎn)錄因子過表達(dá)+啟動(dòng)子野生型+海腎內(nèi)參(TK)

（6）轉(zhuǎn)錄因子過表達(dá)+啟動(dòng)子突變型+海腎內(nèi)參(TK)

實(shí)驗(yàn)預(yù)期結(jié)果

轉(zhuǎn)錄因子促進(jìn)靶基因啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄活性

轉(zhuǎn)錄因子抑制靶基因啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄活性

翌圣可提供雙熒光素酶報(bào)告基因檢測服務(wù),，加快基礎(chǔ)研究及藥物篩選進(jìn)度

服務(wù)類型	客戶提供	服務(wù)內(nèi)容	周期
雙熒光素酶驗(yàn)證miRNA 與靶基因3’UTR 相互作用	1,、miRNA基因及物種（具體的ID信息） 2、靶基因基因及物種 3. 結(jié)合位點(diǎn)信息	1、miRNA與3’UTR結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測 2,、方案設(shè)計(jì),、引物設(shè)計(jì)合成 3、miRNA mimics合成,、質(zhì)粒構(gòu)建 4,、細(xì)胞轉(zhuǎn)染及報(bào)告基因檢測	25-30個(gè)工作日
雙熒光素酶驗(yàn)證lncRNA 與miRNA 相互作用	1、lcnRNA基因及物種 2,、miRNA基因及物種（具體的ID信息） 3,、結(jié)合位點(diǎn)信息	1、lncRNA 與miRNA結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測 2,、方案設(shè)計(jì),、引物設(shè)計(jì)合成 3,、miRNA mimics合成,、質(zhì)粒構(gòu)建 4、細(xì)胞轉(zhuǎn)染及報(bào)告基因檢測	25-30個(gè)工作日
雙熒光素酶驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子區(qū)調(diào)控作用	1,、啟動(dòng)子信息（名稱,、物種、序列） 2,、啟動(dòng)子基因模板（或委托我司合成/克?。?/span> 3、實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞（若選用293T細(xì)胞無需提供）	1,、轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測 2,、方案設(shè)計(jì)、引物設(shè)計(jì)合成 3,、序列合成,、質(zhì)粒構(gòu)建 4、細(xì)胞轉(zhuǎn)染及報(bào)告基因檢測	30-35個(gè)工作日
信號(hào)通路分析	通路下游的響應(yīng)元件序列	1,、方案設(shè)計(jì),、引物設(shè)計(jì)合成 2、序列合成,、質(zhì)粒構(gòu)建 3,、細(xì)胞轉(zhuǎn)染及報(bào)告基因檢測	30-35個(gè)工作日
SNP 活性分析	基因的啟動(dòng)子區(qū)域存在單核苷酸多態(tài)性（SNP)信息	1、方案設(shè)計(jì),、引物設(shè)計(jì)合成 2,、序列合成、質(zhì)粒構(gòu)建 3,、細(xì)胞轉(zhuǎn)染及報(bào)告基因檢測	30-35個(gè)工作日

相關(guān)產(chǎn)品清單

產(chǎn)品類別	產(chǎn)品名稱	產(chǎn)品貨號(hào)	產(chǎn)品規(guī)格
雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑	Dual Luciferase Reporter Gene Assay Kit 雙螢光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒	11402ES60/80	100T/1000T
雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑	Dual Glo Luciferase Reporter Gene Assay Kit 輝光型雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒	11405ES60/80	100T/1000T
轉(zhuǎn)染試劑	Hieff Trans® Liposomal Transfection Reagent 轉(zhuǎn)染試劑	40802ES01/03	100μL/1mL
	Hieff Trans® in vitro siRNA/miRNA Transfection Reagent轉(zhuǎn)染試劑	40806ES01/02/03	0.1mL/0.5mL /1mL
	Hieff Trans® mRNA Transfection Reagent 轉(zhuǎn)染試劑	40809ES01/03	0.1mL/1mL

相關(guān)產(chǎn)品

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