活性氧（ROS）和活性氮（RNS）是已知的導致氧化應激有害效應的分子,。自由基的積累以及氧化應激的增加已被認為與多種疾病的發(fā)生機制有關,。氧化應激在血管疾病、糖尿病,、腎臟缺血,、動脈粥樣硬化、肺部病理狀態(tài),、炎癥性疾病,、癌癥以及衰老中的作用已被廣泛證實,。自由基和其他活性物質(zhì)在體內(nèi)不斷產(chǎn)生，并對生物分子造成氧化損傷,，這一過程通過多種抗氧化和修復系統(tǒng)以及受損核酸,、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的替換來控制。測量抗氧化療法的效果以及ROS/RNS活性對于抑制或治療氧化應激誘導因子至關重要,。

OxiSelect™體外ROS/RNS檢測試劑盒是一種用于測量樣本中總自由基含量的檢測工具,。該試劑盒采用一種專有的淬滅型熒光探針——二氯二氫熒光素DiOxyQ（DCFH-DiOxyQ），這是一種基于流行的2',7'-二氯二氫熒光素二乙酸酯類似化學原理的特異性ROS/RNS探針,。DCFH-DiOxyQ探針首先用淬滅去除試劑進行預處理,，隨后穩(wěn)定在高活性的DCFH形式中。在這種高活性狀態(tài)下,，ROS和RNS可以與DCFH反應,，DCFH迅速被氧化為高熒光的2',7'-二氯熒光素（DCF）。熒光強度與樣本中的總ROS/RNS水平成正比,。DCFH-DiOxyQ探針可以與過氧化氫（H?O?）,、過氧自由基（ROO?）、一氧化氮（NO）和過氧亞硝酸根（ONOO?）反應,。這些自由基分子分別代表了ROS和RNS,，從而可以測量樣本中的總自由基群體。OxiSelect™體外ROS/RNS檢測試劑盒還可以用于評估抗氧化劑對自由基的影響,。該試劑盒對DCF的檢測靈敏度為10 pM,，對H?O?的檢測靈敏度為40 nM。每個試劑盒提供足夠的試劑,，可進行多達96次檢測,，包括標準曲線和未知樣本。

艾美捷OxiSelect體外ROS/RNS檢測試劑盒(綠色熒光)（#STA-347）是一種體外檢測工具,，用于測量總ROS/RNS自由基活性,。未知的ROS或RNS樣本或標準品與一種催化劑一起加入孔中，該催化劑有助于加速氧化反應,。經(jīng)過短暫孵育后,，將制備好的DCFH探針加入所有孔中，允許氧化反應進行（見圖1）,。樣本通過熒光法與過氧化氫或DCF標準品進行測量,。該檢測在96孔熒光平板格式中進行，可在標準熒光平板讀數(shù)器上讀取,。通過與預先確定的DCF或過氧化氫標準曲線比較,，確定未知樣本中的自由基含量。

OxiSelect體外ROS/RNS檢測試劑盒組分（室溫運輸）：

1. 預處理試劑（部件編號234701）：1支250 µL溶液管,。

2. 穩(wěn)定化溶液（10X）（部件編號234702）：1支1.5 mL溶液管,。

3. 催化劑（250X）（部件編號234703）：1支20 µL溶液管,。

4. DCF-DiOxyQ（部件編號234704）：1支50 µL棕色管，甲醇溶液,。

5. DCF標準品（部件編號234202）：1支100 µL棕色管,，1 mM DMSO溶液。

6. 過氧化氫（部件編號234102）：1支100 µL棕色管,，8.821 M溶液,。

未提供材料：

1. 磷酸鹽緩沖液，用于樣本制備和稀釋

2. 96孔黑色或熒光微量滴定板

儲存：

收到后,，將DCF-DiOxyQ和DCF標準品儲存于-20oC,。避免多次凍融循環(huán)。將所有其他組分儲存于4oC,。

試劑準備：

- 1X穩(wěn)定化溶液：將10X穩(wěn)定化溶液按1:10稀釋,，即向1.5 mL溶液中加入13.5 mL去離子水。攪拌或渦旋至均勻,。將溶液儲存于4oC,。

- 1X催化劑：使用前，將250X催化劑在PBS中按1:250稀釋,。充分渦旋,。僅準備足夠立即使用的量（例如，向2.49 mL PBS中加入10 µL催化劑,，用于50孔）,。

- DCFH溶液：僅在棕色管或用鋁箔覆蓋的管中準備足夠立即使用的DCFH溶液。通過將DCF-DiOxyQ原液與預處理試劑按1:5稀釋來制備DCFH溶液（例如,，對于50次檢測,，向100 µL預處理試劑中加入25 µL DCF-DiOxyQ）。渦旋至均勻,。在室溫下孵育溶液30分鐘,。然后，將反應液用1X穩(wěn)定化溶液按1:40稀釋（例如,，對于50次檢測,，將125 µL DCF-DiOxyQ/預處理試劑反應液加入到4.875 mL穩(wěn)定化溶液中）。渦旋至均勻,。避光保存,。該溶液現(xiàn)在以DCFH形式穩(wěn)定，可直接使用,。當避光保存時，該溶液可在-20oC下穩(wěn)定保存長達一周,。

注意：由于光誘導的自氧化作用,，DCF-DiOxyQ原液以及所有后續(xù)的DCF-DiOxyQ和DCFH溶液都必須避光保存,。

結果示例：

以下圖表展示了典型的自由基ROS/RNS檢測結果。熒光測量是在Molecular Devices的SpectraMax Gemini XS熒光光度計上進行的,，使用485/538 nm濾光片組和530 nm截止濾光片,。以下數(shù)據(jù)僅供參考，不應用于解釋實際結果,。

過氧化氫標準曲線

相關產(chǎn)品：

1. STA-330：OxiSelect™ TBARS檢測試劑盒（丙二醛定量）

2. STA-340：OxiSelect™超氧化物歧化酶活性檢測試劑盒

3. STA-341：OxiSelect™過氧化氫酶活性檢測試劑盒

4. STA-342：OxiSelect™細胞內(nèi)ROS檢測試劑盒（綠色熒光）

5. STA-832：OxiSelect™丙二醛加合物競爭性ELISA試劑盒

OxiSelect體外ROS/RNS檢測試劑盒(綠色熒光)引用文獻：

1. Bass DA, Parce JW, Dechatelet LR, Szejda P, Seeds MC, Thomas M. Flow cytometric studies of oxidative product formation by neutrophils: A graded response to membrane stimulation. J Immunol.1983; 130:1910-1917.

2. Brandt R, Keston AS. Synthesis of diacetyldichlorofluorescin: A stable reagent for fluorometric analysis. Anal Biochem. 1965; 11:6-9.

3. Keston AS, Brandt R. The fluorometric analysis of ultramicro quantities of hydrogen peroxide. Anal Biochem.1965; 11:1-5.