蛋氨酸是一種動(dòng)物必需的氨基酸，因此必須通過飲食來源獲取,。在雞蛋,、肉類、魚類以及芝麻,、巴西果仁和其他一些植物種子中可以檢測(cè)到高含量的蛋氨酸,。大多數(shù)水果和蔬菜中蛋氨酸含量較低。除了在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能中的傳統(tǒng)作用外,，蛋氨酸還作為合成其他氨基酸（如半胱氨酸和?；撬幔┮约爸匾目寡趸瘎┕入赘孰牡耐緩街械牡孜铩５鞍彼釋?duì)人類和許多其他物種的代謝至關(guān)重要,。蛋氨酸在血管生成過程中發(fā)揮重要作用,，血管生成是新血管的生長(zhǎng)過程。補(bǔ)充蛋氨酸可能對(duì)銅中毒有益,。然而,，許多研究表明，攝入過多的蛋氨酸與癌癥生長(zhǎng)有關(guān),。

Cell Biolabs的蛋氨酸檢測(cè)試劑盒是一種簡(jiǎn)單的熒光法檢測(cè),，用于在96孔微量滴定板格式中測(cè)量生物樣本中總蛋氨酸的含量。每個(gè)試劑盒提供足夠的試劑,，可進(jìn)行多達(dá)100次檢測(cè)（包括空白,、蛋氨酸標(biāo)準(zhǔn)品和未知樣本）。通過與已知濃度的蛋氨酸標(biāo)準(zhǔn)品比較來確定樣本中的蛋氨酸濃度,。該試劑盒的檢測(cè)靈敏度為1.5 µM蛋氨酸,。

注意：每個(gè)樣本重復(fù)需要2次檢測(cè)，一次用S-腺苷蛋氨酸合成酶（+AdoMetS）處理,，一次不處理（-AdoMetS）,。通過計(jì)算兩個(gè)孔的相對(duì)熒光單位（RFU）讀數(shù)的差異來計(jì)算蛋氨酸含量。

艾美捷蛋氨酸檢測(cè)試劑盒（#MET-5158）檢測(cè)原理：

Cell Biolabs的蛋氨酸檢測(cè)試劑盒通過測(cè)量生物樣本中的總蛋氨酸含量,。蛋氨酸和ATP在S-腺苷蛋氨酸合成酶的作用下轉(zhuǎn)化為S-腺苷蛋氨酸,、無機(jī)磷酸鹽和焦磷酸鹽。磷酸烯醇丙酮酸和焦磷酸鹽在磷酸丙酮酸二激酶的作用下轉(zhuǎn)化為丙酮酸,。丙酮酸在丙酮酸氧化酶的作用下,，在磷酸鹽和氧氣的存在下轉(zhuǎn)化為乙酰磷酸、二氧化碳和過氧化氫,。隨后通過高特異性的熒光探針檢測(cè)生成的過氧化氫,。辣根過氧化物酶催化探針與過氧化氫之間的反應(yīng),，它們以1:1的比例結(jié)合。樣本與已知濃度的蛋氨酸標(biāo)準(zhǔn)品在96孔微量滴定板格式中進(jìn)行比較,。樣本和標(biāo)準(zhǔn)品孵育30分鐘后,，使用標(biāo)準(zhǔn)的96孔熒光平板讀數(shù)器進(jìn)行讀取（圖1）,。

圖1. 蛋氨酸檢測(cè)原理

蛋氨酸檢測(cè)試劑盒組分：

盒子1（干冰運(yùn)輸）

1. 蛋氨酸標(biāo)準(zhǔn)品（部件編號(hào)51581C）：1支50 µL試管,，濃度為10 mM。

2. ATP（部件編號(hào)51583C）：1支50 µL試管,，腺苷三磷酸（ATP）濃度為200 mM,。

3. AMP（部件編號(hào)51584C）：1支50 µL試管，腺苷單磷酸（AMP）濃度為20 mM,。

4. PEP（部件編號(hào)51585C）：1支50 µL試管，磷酸烯醇丙酮酸（PEP）濃度為100 mM,。

5. 熒光探針（部件編號(hào)50231C）：1支50 µL試管,，溶劑為DMSO。

6. HRP（部件編號(hào)234402-T）：1支10 µL試管,，100 U/mL的甘油溶液,。

7. FAD（部件編號(hào)50293C）：1支50 µL試管，黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）濃度為2 mM,。

8. TPP（部件編號(hào)50294C）：1支50 µL試管,，硫胺素焦磷酸（TPP）濃度為2 mM。

9. 丙酮酸氧化酶（部件編號(hào)50295C）：1支300 µL試管,。

10. AdoMetS（部件編號(hào)51587D）：1支150 µL試管,，S-腺苷蛋氨酸合成酶（AdoMetS）。

11. PPDK（部件編號(hào)51588D）：1支200 µL試管,，磷酸丙酮酸二激酶（PPDK）,。

盒子2（干冰運(yùn)輸）

1. 10X檢測(cè)緩沖液（部件編號(hào)51582A）：1瓶25 mL。

2. Na?HPO?（部件編號(hào)51586A）：1支50 µL試管,，磷酸氫二鈉（Na?HPO?）濃度為100 mM,。

未提供材料：

1. 蒸餾水或去離子水

2. 10 kDa分子量截止（MWCO）離心過濾器（例如Amicon Ultra 0.5 mL）

3. 標(biāo)準(zhǔn)96孔黑色熒光微量滴定板和/或黑色細(xì)胞培養(yǎng)微量滴定板

儲(chǔ)存：

將10X檢測(cè)緩沖液和Na?HPO?在室溫下保存。將AdoMetS和PPDK在-80oC下保存,。將所有其他組分在-20oC下保存,。熒光探針對(duì)光敏感，必須相應(yīng)保存,。避免多次凍融循環(huán),。

樣本準(zhǔn)備：

- 細(xì)胞培養(yǎng)上清液：應(yīng)避免使用含有丙酮酸的細(xì)胞培養(yǎng)基。為了去除不溶性顆粒,，以10,000 rpm離心5分鐘,。收集上清液，并用10kDa離心過濾器過濾溶液以去除蛋白。收集濾液,。濾液可以直接用于檢測(cè),，或根據(jù)需要稀釋到PBS中。

  注意：維持pH在7到8之間以獲得最佳工作條件,，因?yàn)闊晒馓结樤诟?span style="font-family: Calibri;">pH（>8.5）下不穩(wěn)定,。

- 組織裂解液：在PBS中超聲或勻漿組織樣本，并在4°C下以10,000 x g離心10分鐘,。收集上清液,，并用10kDa離心過濾器過濾溶液以去除蛋白。收集濾液,。濾液可以直接用于檢測(cè),，或根據(jù)需要稀釋到PBS中。

- 細(xì)胞裂解液：將細(xì)胞重懸于PBS中,。在冰上勻漿或超聲處理細(xì)胞,。離心去除雜質(zhì)。收集上清液,，并用10kDa離心過濾器過濾溶液以去除蛋白,。收集濾液。濾液可以未稀釋或根據(jù)需要稀釋到PBS中用于檢測(cè),。

- 血清,、血漿、唾液或尿液：為了去除不溶性顆粒,，以10,000 rpm離心5分鐘,。收集上清液，并用10kDa離心過濾器過濾溶液以去除蛋白,。收集濾液,。濾液可以直接用于檢測(cè)，或根據(jù)需要稀釋到PBS中,。

注意事項(xiàng)：

- 所有樣本應(yīng)立即進(jìn)行檢測(cè),，或在-80°C下儲(chǔ)存最長(zhǎng)1-2個(gè)月。根據(jù)需要運(yùn)行適當(dāng)?shù)膶?duì)照組,。樣本的最佳實(shí)驗(yàn)條件需由研究者自行確定,。始終與樣本一起運(yùn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線。

- NADH濃度高于10 µM和谷胱甘肽濃度高于50 µM的樣本會(huì)氧化熒光探針,，可能導(dǎo)致錯(cuò)誤的讀數(shù),。為了盡量減少這種干擾，建議在反應(yīng)中加入超氧化物歧化酶（SOD）,，最終濃度為40 U/mL（參考文獻(xiàn)2）,。

- 避免使用含有DTT或β-巰基乙醇的樣本,，因?yàn)闊晒馓结樤诹虼迹ǜ哂?span style="font-family: Calibri;">10 µM）存在時(shí)不穩(wěn)定。

相關(guān)產(chǎn)品：

1. MET-5029：丙酮酸檢測(cè)試劑盒（熒光法）

2. MET-5001：乳糖檢測(cè)試劑盒（熒光法）

3. MET-5013：乳酸檢測(cè)試劑盒（熒光法）

4. MET-5023：糖原檢測(cè)試劑盒（熒光法）

5. STA-399：游離甘油檢測(cè)試劑盒（熒光法）

蛋氨酸檢測(cè)試劑盒引用文獻(xiàn)：

1. Finkelstein JD (1990). J. of Nutr. Biochem. 1: 228–37.

2. Votyakova TV, and Reynolds IJ (2001) Neurochem. 79:266.

3. Longchamp A, Mirabella T 2, Arduini A, MacArthur MR, Das A, Trevi?o-Villarreal JH, Hine C,

Ben-Sahra I, Knudsen NH, Brace LE, Reynolds J, Mejia P, Tao M, Sharma G, Wang R, Corpataux

J-M, Haefliger J-A, Ahn KH, Lee C-H, Manning BD, Sinclair DA, Chen CS, Ozaki CK, and

Mitchell JR. (2018) Cell 22:117-129

4. Cavuoto P, Fenech MF (2012). Cancer Treat. Rev. 38: 726–736.

5. Cellarier E, Durando X, Vasson MP, Farges MC, Demiden A, Maurizis JC, Madelmont JC, Chollet

P (2003). Cancer Treat. Rev. 29: 489–499.