一、知識(shí)簡(jiǎn)介

革蘭氏染色法是細(xì)菌學(xué)中廣泛使用的一種鑒別染色法,，這種染色法是由一位丹麥醫(yī)生漢斯·克里斯蒂安·革蘭（Hans Christian Gram,，1853年－1938年）于1884年所發(fā)明，最初是用來(lái)鑒別肺炎球菌與克雷白氏肺炎菌之間的關(guān)系,。

未經(jīng)染色之細(xì)菌,，由于其與周?chē)h(huán)境折光率差別甚小，故在顯微鏡下極難觀察,。染色后細(xì)菌與環(huán)境形成鮮明對(duì)比,，可以清楚地觀察到細(xì)菌的形態(tài)、排列及某些結(jié)構(gòu)特征,，而用以分類(lèi)鑒定,。

革蘭氏染色（Gram Staining）是用來(lái)鑒別細(xì)菌的一種方法：這種染色法利用細(xì)菌細(xì)胞壁上的生物化學(xué)性質(zhì)不同，可將細(xì)菌分成兩類(lèi),，即革蘭氏陽(yáng)性（Gram Positive）與革蘭氏陰性（Gram Negative）,。這一染色方法由丹麥醫(yī)生漢斯·克里斯蒂安·革蘭于1884年所發(fā)明，最初是用來(lái)鑒別肺炎球菌與克雷白氏肺炎菌之間的關(guān)系,，后推廣為鑒別細(xì)菌種類(lèi)的重要特性之一,，對(duì)由細(xì)菌感染引起的疾病的臨床診斷及治療有著廣泛用途。

二,、臨床意義

其重要的臨床意義在于：1.鑒別細(xì)菌 2.選擇藥物 3.與致病性有關(guān)：革蘭氏陽(yáng)性菌能產(chǎn)生外毒素,，革蘭氏陰性菌能產(chǎn)生內(nèi)毒素,；而內(nèi)毒素主要是指革蘭氏陰性菌胞壁成分中的脂多糖,，兩者的致病作用不同,。

三,、實(shí)驗(yàn)方法

1、步驟

革蘭氏染色法一般包括初染、媒染,、脫色,、復(fù)染等四個(gè)步驟,，具體操作方法是：

1）涂片固定,。

2）草酸銨結(jié)晶紫染1分鐘。

3）蒸餾水沖洗,。

4）加碘液覆蓋涂面染約1分鐘,。

5）水洗，用吸水紙吸去水分,。

6）加95%酒精數(shù)滴,，并輕輕搖動(dòng)進(jìn)行脫色,，20秒后水洗,，吸去水分,。

7）番紅染色液（?。┤?分鐘后,，蒸餾水沖洗,。干燥，鏡檢,。

2,、原理

通過(guò)結(jié)晶紫初染和碘液媒染后，在細(xì)胞壁內(nèi)形成了不溶于水的結(jié)晶紫與碘的復(fù)合物,，革蘭氏陽(yáng)性菌由于其細(xì)胞壁較厚,、肽聚糖網(wǎng)層次較多且交聯(lián)致密，故遇乙醇或丙酮脫色處理時(shí),，因失水反而使網(wǎng)孔縮小,，再加上它不含類(lèi)脂，故乙醇處理不會(huì)出現(xiàn)縫隙,，因此能把結(jié)晶紫與碘復(fù)合物牢牢留在壁內(nèi),，使其仍呈紫色；而革蘭氏陰性菌因其細(xì)胞壁薄,、外膜層類(lèi)脂含量高,、肽聚糖層薄且交聯(lián)度差，在遇脫色劑后,，以類(lèi)脂為主的外膜迅速溶解,，薄而松散的肽聚糖網(wǎng)不能阻擋結(jié)晶紫與碘復(fù)合物的溶出，因此通過(guò)乙醇脫色后仍呈無(wú)色,，再經(jīng)沙黃等紅色染料復(fù)染,，就使革蘭氏陰性菌呈紅色。

染色的差異主要是陰性與陽(yáng)性細(xì)菌細(xì)胞壁的差異所引起的,。

①革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的細(xì)胞壁

G+細(xì)菌細(xì)胞壁具有較厚（20-80nm）而致密的肽聚糖層,，多達(dá)50層，占細(xì)胞壁成分的40%～95%,，它同細(xì)胞膜的外層緊密相連（圖2-9）,。有的G+細(xì)菌細(xì)胞壁中含有磷壁酸（teichoic-acid），也稱胞壁質(zhì)（murein）,，它是甘油和核糖醇的聚合物,，磷壁酸通常以糖或氨基酸的酯而存在。由于磷壁酸帶負(fù)電荷,，它在細(xì)胞表面能調(diào)節(jié)陽(yáng)離子濃度,。磷壁酸與細(xì)胞生長(zhǎng)有關(guān)，細(xì)胞生長(zhǎng)中有自溶素（autolysins）酶類(lèi)起作用,，磷壁酸對(duì)自溶素有調(diào)節(jié)功能,，阻止胞壁過(guò)度降解和壁溶。

如果細(xì)胞壁的肽聚糖層被消溶,，G+細(xì)胞成為原生質(zhì)體（protoplasts）,，細(xì)胞壁不復(fù)存在，而只存留細(xì)胞膜,。除鏈球菌外,，大多數(shù)G+細(xì)菌細(xì)胞壁中含極少蛋白質(zhì)。

②革蘭氏陰性細(xì)菌的細(xì)胞壁 G—細(xì)菌細(xì)胞壁比G+細(xì)菌細(xì)胞壁?。?5～20nm）而結(jié)構(gòu)較復(fù)雜,，分外膜（outer membrane）和肽聚糖層（2～3nm）。在細(xì)胞壁和細(xì)胞質(zhì)膜之間有一個(gè)明顯的空間,，稱為壁膜間隙（periplasmic space）,。

外膜 G—細(xì)菌細(xì)胞壁外膜的基本成分是脂多糖（lipopolysaccharide,LPS），它同細(xì)胞質(zhì)膜相同之處也是雙層類(lèi)脂,，但除磷脂外還含有多糖和蛋白質(zhì),。

LPS的多糖部分包括核心多糖和O-特異多糖。O-特異多糖由重復(fù)分支的碳水化合物分子組成,，含有已糖（葡萄糖,、半乳糖和鼠李糖）和二脫氧已糖,。由于糖的種類(lèi)不同，使各種G—細(xì)胞具有不同特性的LPS,。核心多糖（core polysaccharide）的主要組分是酮脫氧辛酸（ketodeoxyoctonate, KDO）,。

外膜中還含有幾種蛋白，如脂蛋白,、通透蛋白,。有些蛋白具有通孔作用（porin），調(diào)控外界分子進(jìn)入細(xì)胞,；有的蛋白分子可以作為噬菌體的受體,；許多G—細(xì)菌對(duì)高等生物有致病性是由LPS的成分決定的，它的毒性組分常稱為內(nèi)毒素（endotoxins）,。

肽聚糖層 G—細(xì)菌細(xì)胞壁的肽聚糖層很薄,，在大腸桿菌和其它細(xì)菌中僅有單層。肽聚糖層和外膜的內(nèi)層之間通過(guò)脂蛋白連接起來(lái),。

壁膜間隙 G—細(xì)菌細(xì)胞壁的外膜與細(xì)胞質(zhì)膜之間存在明顯的壁膜間隙,，一層薄的肽聚糖處于其間，肽聚糖層和細(xì)胞質(zhì)膜之間的間隙較寬,，肽聚糖層至外膜之間的間隙較窄,。大腸桿菌的壁膜間隙寬度為12～15nm，呈膠胨態(tài),。其間含有三類(lèi)蛋白質(zhì)：水解酶,，催化食物的初步降解；結(jié)合蛋白,，啟動(dòng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程,；化學(xué)受體（chemoreceptors），在趨化性中起作用的蛋白,。

3,、染色結(jié)果

革蘭氏陽(yáng)性菌呈藍(lán)紫色，革蘭氏陰性菌呈紅色,。

四,、相關(guān)研究

致病菌與抗菌藥選擇

革蘭氏陽(yáng)性菌：葡萄球菌屬（主要是金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌等）,、鏈球菌屬（肺炎鏈球菌,、草綠色鏈球菌、腸球菌等）,、白喉?xiàng)U菌,、炭疽桿菌、破傷風(fēng)桿菌、蠟樣芽孢桿菌等,，其中,，金黃色葡萄球菌、腸球菌等為臨床重要的病原菌,。

革蘭氏陽(yáng)性菌通常對(duì)青霉素類(lèi),、（或第二）代頭孢菌素,、萬(wàn)古霉素,、克林霉素等高度敏感，但是因?yàn)榭股氐臑E用,，MRSA/MRSE,、VRSA/VISA、PISP/PRSP,、VRE等多重耐藥菌已經(jīng)嚴(yán)重威脅著人類(lèi)的生命,，這些細(xì)菌感染時(shí)，可以考慮使用萬(wàn)古霉素,、共殺素（奎奴普丁/達(dá)福普?。⒗芜虬?、達(dá)托霉素,、泰利霉素、夫西地酸（建議與耐酶的青霉素類(lèi)或利福平聯(lián)用）等,。另外,，CNS（凝固酶陰性葡萄球菌）等細(xì)菌也要引起足夠等重視。

革蘭氏陰性菌：埃希氏菌屬,、枸櫞酸菌屬,、假單胞菌屬（綠膿桿菌等）、莫拉菌屬（卡他莫拉菌等）,、奈瑟菌屬（淋球菌,、腦膜炎雙球菌等）、不動(dòng)桿菌屬（鮑曼不動(dòng)桿菌,、羅菲不動(dòng)桿菌等）,、克雷伯菌屬（主要是肺炎克雷伯桿菌）、沙門(mén)氏菌屬,、志賀氏菌屬（痢疾桿菌等）,、黃桿菌屬、變形桿菌屬,、軍團(tuán)菌屬,、耶爾森菌屬、嗜血桿菌屬（杜克雷嗜血桿菌、流感嗜血桿菌等）,、產(chǎn)氣桿菌屬,、霍亂弧菌、陰溝腸桿菌等,。革蘭氏陰性菌在院內(nèi)感染中的細(xì)菌感染中占了大約65%,，且大多菌株容易對(duì)抗菌藥物耐藥，產(chǎn)生“新德里金屬酶”（NDM-1）的絕大多數(shù)細(xì)菌都是革蘭氏陰性菌（主要是大腸桿菌,、鮑曼不動(dòng)桿菌和肺炎克雷伯桿菌）,。

革蘭氏陰性菌對(duì)第三代頭孢菌素（頭孢他啶、頭孢噻肟,、頭孢曲松等）,、氨基糖苷類(lèi)（慶大霉素、妥布霉素等）,、抗假單胞菌屬的青霉素類(lèi)（哌拉西林,、替卡西林、羧芐西林等）,、多粘菌素等高度敏感,，對(duì)頭霉素類(lèi)和第二代頭孢菌素也較敏感，但是,，MDR-AB/PDR-AB,、PDR-PA等多重耐藥菌給臨床用藥帶來(lái)過(guò)很大的困難。多粘菌素,、碳青霉烯類(lèi)（亞胺培南,、美羅培南等）、替加環(huán)素等可以用于多重耐藥菌等治療,，但要慎用,，否則很可能會(huì)到無(wú)藥可醫(yī)的地步（綠膿桿菌和鮑曼不動(dòng)桿菌的一些菌株甚至已經(jīng)對(duì)碳青霉烯類(lèi)有耐藥性）。值得注意的是,，頭孢哌酮/舒巴坦,、哌拉西林/他唑巴坦、替卡西林/克拉維酸,、氧頭孢烯類(lèi)（拉氧頭孢,、氟氧頭孢等）對(duì)某些多重耐藥菌也有，比如產(chǎn)ESBLs或AmpC酶的菌株,，可以考慮與其他抗菌藥物（磷霉素等）聯(lián)用,，另外，多西環(huán)素和多粘菌素聯(lián)用時(shí),，幾乎對(duì)所有對(duì)細(xì)菌都有協(xié)同抗菌作用,，也可考慮。

根據(jù)細(xì)菌的革蘭氏染色性質(zhì)，可以縮小鑒定范圍,，有利于進(jìn)一步分離鑒定,，以對(duì)疾病做出診斷。又由于各種抗生素的抗菌譜不同,，革蘭氏染色尚可做為選用抗生素的參考,。

五、可能誤差

在實(shí)驗(yàn)中經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性和假陰性的結(jié)果,，假陽(yáng)性主要是由于脫色不,，可能是由于涂片過(guò)厚，或者是結(jié)晶紫染色過(guò)度,，導(dǎo)致脫色不,。假陰性可能是因?yàn)榧?xì)胞固定過(guò)度,，造成細(xì)胞壁通透性的改變,，而出現(xiàn)假陰性結(jié)果；另外,，細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間太長(zhǎng),，可能已經(jīng)有部分細(xì)胞發(fā)生死亡或者自溶，也導(dǎo)致細(xì)胞壁通透性的改變而出現(xiàn)假陰性結(jié)果,。

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