一,、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/span>

1,、了解并掌握培養(yǎng)基的配制,、分裝方法。

2,、掌握各種實(shí)驗(yàn)室滅菌方法及技術(shù),。

二、實(shí)驗(yàn)原理

培養(yǎng)基是供微生物生長,、繁殖、代謝的混合養(yǎng)料,。由于微生物具有不同的營養(yǎng)類型,，對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的要求也各不相同，加之實(shí)驗(yàn)和研究的目的不同,，所以培養(yǎng)基的種類很多,，使用的原料也各有差異，但從營養(yǎng)角度分析,，培養(yǎng)基中一般含有微生物所必需的碳源,、氮源、無機(jī)鹽,、生長素以及水分等,。另外，培養(yǎng)基還應(yīng)具有適宜的pH值,、一定的緩沖能力,、一定的氧化還原電位及合適的滲透壓。

瓊脂是從石花菜等海藻中提取的膠體物質(zhì),，是應(yīng)用的凝固劑,。加瓊脂制成的培養(yǎng)基在98～100℃下融化，于45℃以下凝固,。但多次反復(fù)融化,，其凝固性降低。

任何一種培養(yǎng)基一經(jīng)制成就應(yīng)及時(shí)滅菌,，以備純培養(yǎng)用,。一般培養(yǎng)基的滅菌采用高壓蒸汽滅菌,。

三、實(shí)驗(yàn)材料

1,、器皿及材料

天平,、稱量紙、牛角匙,、精密pH試紙,、量筒、刻度搪瓷杯,、試管,、三角瓶、漏斗,、分裝架,、移液管及移液管筒、培養(yǎng)皿及培養(yǎng)皿盒,、玻璃棒,、燒杯、試管架,、鐵絲筐,、剪刀、酒精燈,、棉花,、線繩、牛皮紙或報(bào)紙,、紗布,、乳膠管、電爐,、滅菌鍋,、干燥箱。

2,、藥品試劑

蛋白胨,、牛肉膏、NaCl,、K2HPO4,、瓊脂、NaNO3,、KCl,、MgSO4、FeSO4,、蔗糖,、麥芽糖,、木糖、葡萄糖,、半乳糖,、乳糖、土豆汁,、豆芽計(jì),、磷酸銨、5%NaOH溶液,、5%HCl溶液,。

四、操作流程

稱藥品→溶解→調(diào)pH值→融化瓊脂→過濾分裝→包扎標(biāo)記→滅菌→擺斜面或倒平板,。

五,、操作步驟

1、培養(yǎng)基的制備

（1）稱量藥品

根據(jù)培養(yǎng)基配方依次準(zhǔn)確稱取各種藥品,，放入適當(dāng)大小的燒杯中,，瓊脂不要加入。蛋白胨極易吸潮,，故稱量時(shí)要迅速,。

（2）溶解

用量筒取一定量(約占總量的1/2)蒸餾水倒入燒杯中，在放有石棉網(wǎng)的電爐上小火加熱,，并用玻棒攪拌，以防液體溢出,。待各種藥品溶解后,，停止加熱，補(bǔ)足水分,。如果配方中有淀粉,，則先將淀粉用少量冷水調(diào)成糊狀，并在火上加熱攪拌,，然后加足水分及其它原料,，待溶化后，補(bǔ)足水分,。

（3）調(diào)節(jié)pH

根據(jù)培養(yǎng)基對(duì)pH的要求,，用5%NaOH或5%HC1溶液調(diào)至所需pH。測(cè)定pH可用pH試紙或酸度計(jì)等,。

（4）溶化瓊脂

固體或半固體培養(yǎng)基須加入一定量瓊脂,。瓊脂加入后，置電爐上一面攪拌一面加熱,，直至瓊脂融化后才能停止攪拌,，并補(bǔ)足水分(水需預(yù)熱),。注意控制火力不要使培養(yǎng)基溢出或燒焦。

（5）過濾分裝

先將過濾裝置安裝好,。如果是液體培養(yǎng)基,，玻璃漏斗中放一層濾紙，如果是固體或半固體培養(yǎng)基,，則需在漏斗中放多層紗布,，或兩層紗布夾一層薄薄的脫脂棉趁熱進(jìn)行過濾。過濾后立即進(jìn)行分裝,。分裝時(shí)注意不要使培養(yǎng)基沾染在管口或瓶口,，以免浸濕棉塞，引起污染,。液體分裝高度以試管高度的1/4左右為宜,。固體分裝裝量為管高的1/5，半固體分裝試管一般以試管高度的1/3為宜,；分裝三角瓶,，其裝量以不超過三角瓶容積的一半為宜。

（6）包扎標(biāo)記

培養(yǎng)基分裝后加好棉塞或試管帽,，再包上一層防潮紙,，用棉繩系好。在包裝紙上標(biāo)明培養(yǎng)基名稱,，制備組別和姓名,、日期等。

（7）滅菌

上述培養(yǎng)基應(yīng)按培養(yǎng)基配方中規(guī)定的條件及時(shí)進(jìn)行滅菌,。普通培養(yǎng)基為121℃20min,，以保證滅菌效果和不損傷培養(yǎng)基的有效成份。培養(yǎng)基經(jīng)滅菌后,，如需要作斜面固體培養(yǎng)基,，則滅菌后立即擺放成斜面(圖3-2)，斜面長度一般以不超過試管長度的1/2為宜,；半固體培養(yǎng)基滅菌后,，垂直冷凝成半固體深層瓊脂。

（8）倒平板

將需倒平板的培養(yǎng)基,，于水浴鍋中冷卻到45～50℃,立刻倒平板,。

2、滅菌方法

滅菌是指殺死或消滅一定環(huán)境中的所有微生物,，滅菌的方法分物理和化學(xué)滅菌法兩大類,。本實(shí)驗(yàn)主要介紹物理方法的一種，即加熱滅菌。

加熱滅菌包括濕熱和干熱滅菌兩種,。通過加熱使菌體內(nèi) 蛋白質(zhì)凝固變性,，從而達(dá)到殺菌目的。蛋白質(zhì)的凝固變性與其自身含水量有關(guān),，含水量越高,，其凝固所需要的溫度越低。在同一溫度下,，濕熱的殺菌效力比干熱大,，因?yàn)樵跐駸崆闆r下，菌體吸收水分,，使蛋白質(zhì)易于凝固,；同時(shí)濕熱的穿透力強(qiáng)，可增加滅菌效力,。

（1）濕熱滅菌

①煮沸消毒法

注射器和解剖器械等均可采用此法,。先將注射器等用紗布包好，然后放進(jìn)煮沸消毒器內(nèi)加水煮沸,。對(duì)于細(xì)菌的營養(yǎng)體煮沸約15～30min,，對(duì)于芽孢則需煮沸約1～2h。

②高壓蒸汽滅菌法

高壓蒸汽滅菌用途廣,，效率高,，是微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中的滅菌方法。這種滅菌方法是基于水的沸點(diǎn)隨著蒸汽壓力的升高而升高的原理設(shè)計(jì)的,。當(dāng)蒸汽壓力達(dá)到1.05kg/cm2時(shí),，水蒸氣的溫度升高到121℃，經(jīng)15～30min,，可全部殺死鍋內(nèi)物品上的各種微生物和它們的孢子或芽孢,。一般培養(yǎng)基、玻璃器皿以及傳染性標(biāo)本和工作服等都可應(yīng)用此法滅菌,。

③操作方法和注意事項(xiàng)如下：

a.加水

打開滅菌鍋蓋,，向鍋內(nèi)加水到水位線,。立式消毒鍋用已煮開過的水,，以便減少水垢在鍋內(nèi)的積存。注意水要加夠,，防止滅菌過程中干鍋,。

b.裝料、加蓋

滅菌材料放好后,，關(guān)閉滅菌器蓋,，采用對(duì)角式均勻擰緊鍋蓋上的螺旋，使蒸汽鍋密閉,，勿使漏氣,。

c.排氣    

打開排氣口(也叫放氣閥),。用電爐加熱，待水煮沸后,，水蒸氣和空氣一起從排氣孔排出,，當(dāng)有大量蒸汽排出時(shí)，維持5min,，使鍋內(nèi)冷空氣排凈,。

d.升壓、保壓和降壓

當(dāng)鍋內(nèi)冷空氣排凈時(shí),，即可關(guān)閉排氣閥,，壓力開始上升。當(dāng)壓力上升至所需壓力時(shí),，控制電壓以維持恒溫,，并開始計(jì)算滅菌時(shí)間，待時(shí)間達(dá)到要求（一般培養(yǎng)基和器皿滅菌控制在121℃,，20min）后,，停止加熱，待壓力降至接近“0”時(shí),，打開放氣閥,。注意不能過早過急地排氣，否則會(huì)由于瓶內(nèi)壓力下降的速度比鍋內(nèi)慢而造成瓶內(nèi)液體沖出容器之外,。

e.滅菌后的培養(yǎng)基空白培養(yǎng)

滅菌后的培養(yǎng)基放于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng),，經(jīng)24h培養(yǎng)無菌生長，可保存?zhèn)溆?；斜面培養(yǎng)基取出后,，立即擺成斜面后空白培養(yǎng)；半固體的培養(yǎng)基垂直放置凝成半固體深層瓊脂后,，空白培養(yǎng),。

（2）干熱滅菌法

通過使用干熱空氣殺滅微生物的方法叫干熱滅菌。一般是把待滅菌的物品包裝就緒后,，放入電烘箱中烘烤,，即加熱至160～170℃維持1～2h。

干熱滅菌法常用于空玻璃器皿,、金屬器具的滅菌,。凡帶有膠皮的物品，液體及固體培養(yǎng)基等都不能用此法滅菌,。

①滅菌前的準(zhǔn)備

玻璃器皿等在滅菌前必須經(jīng)正確包裹和加塞,，以保證玻璃器皿于滅菌后不被外界雜菌所污染。常用玻璃器皿的包扎和加塞方法如下：平皿用紙包扎或裝在金屬平皿筒內(nèi)；三角瓶在棉塞與瓶口外再包以厚紙,，用棉繩以活結(jié)扎緊,，以防滅菌后瓶口被外部雜菌所污染；吸管以拉直的曲別針一端放在棉花的中心,，輕輕捅入管口,，松緊必須適中，管口外露的棉花纖維統(tǒng)一通過火焰燒去,，滅菌時(shí)將吸管裝入金屬管筒內(nèi)進(jìn)行滅菌,，也可用紙條斜著從吸管包起，逐步向上卷,，頭端的紙卷捏扁并擰幾下,，再將包好的吸管集中滅菌。

②干燥箱滅菌

將包扎好的物品放入干燥烘箱內(nèi),，注意不要擺放太密,，以免妨礙空氣流通；不得使器皿與烘箱的內(nèi)層底板直接接觸,。將烘箱的溫度升至160～170℃并恒溫1～2h,，注意勿使溫度過高，超過170℃,，器皿外包裹的紙張,、棉花會(huì)被烤焦燃燒。如果是為了烤干玻璃器皿,，溫度為120℃持續(xù)30分鐘即可,。溫度降至60～70℃時(shí)方可打開箱門，取出物品,，否則玻璃器皿會(huì)因驟冷而爆裂,。用此法滅菌時(shí)，絕不能用油,、蠟紙包扎物品,。

③火焰滅菌

直接用火焰灼燒滅菌，迅速,。對(duì)于接種環(huán),，接種針或其它金屬用具，可直接在酒精燈火焰上燒至紅熱進(jìn)行滅菌,。此外,，在接種過程中,，試管或三角瓶口,，也采用通過火焰而達(dá)到滅菌的目的。

六、結(jié)果

1,、記錄各種不同物品所用的滅菌方法及滅菌條件（溫度,、壓力等）。

2,、試述高壓蒸汽滅菌的過程及注意事項(xiàng),。

七、思考

1,、制備培養(yǎng)基的一般程序是什么,？

2、做過本次實(shí)驗(yàn)后,，你認(rèn)為在制備培養(yǎng)基時(shí)要注意些什么問題,？

3、滅菌在微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)操作中有何重要意義,？

4,、試述高壓蒸汽滅菌的操作方法和原理。

5,、高壓蒸汽滅菌時(shí)應(yīng)注意哪些事項(xiàng),？

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