NAD-蘋果酸酶（Malic enzyme，NAD-ME）試劑盒說明書

微量法 100 管/96 樣

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定測(cè)定意義：

ME 廣泛存在于微生物、培養(yǎng)細(xì)胞、動(dòng)物和植物胞漿中，尤其在植物組織中活性較高,。ME 催化蘋果酸氧化脫羧的可逆反應(yīng)，產(chǎn)生丙酮酸和CO2，以及伴隨NAD(P)+的還原反應(yīng),，是蘋果酸代謝的關(guān)鍵酶。 ME 活性與生物合成和抗氧化密切相關(guān),。近年來植物 ME 活性測(cè)定較多,，已經(jīng)成為抗氧化研究的熱點(diǎn)。根據(jù)輔酶專一性和對(duì)底物特異性的不同,，可將ME 分為NAD-ME(EC1.1.1.38)和NADP-ME(EC1.1.1.40),。

測(cè)定原理：

NAD-ME 催化NAD+還原成NADH，在 340nm 下測(cè)定NADH 增加速率,。

組成：

自備儀器和用品：

紫外分光光度計(jì),、水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī),、可調(diào)式移液器,、1 ml 石英比色皿和蒸餾水。

樣本的前處理：

1,、細(xì)菌,、細(xì)胞或組織樣品的制備：

細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi),，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴ 個(gè)）：提取液體積（ml）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1ml 提取液）,，超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴,，功率 20％或 200W，超聲 3s,，間隔 10s,，重復(fù) 30 次）；8000g 4℃離心 10min,，取上清,，置冰上待測(cè)。

組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織,，加入 1ml 提取液）,，進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min,，取上清,，置冰上待測(cè)。

2,、血清（漿）樣品：直接檢測(cè),。

測(cè)定步驟：

1、分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上,，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 340nm,，蒸餾水調(diào)零。

2,、檢測(cè)工作液的配制：用時(shí)在試劑三中加入 15ml 試劑一和 1ml 蒸餾水,，充分混勻待用；用不完的試劑分裝后-20℃保存,，禁止反復(fù)凍融,。

3、測(cè)定前將檢測(cè)工作液在 37℃（哺乳動(dòng)物）或 25℃（其它物種）水浴 10min 以上,。

4,、在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 10μl 樣本、55μl 試劑二和 160μl 工作液,，混勻后立即記錄 340nm

處初始吸光值A1 和 1min 后的吸光值A2,，計(jì)算ΔA=A2-A1。 注意：如果ΔA＜0.005,，可將反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)到 2 分鐘或 5 分鐘,。 NAD-ME 活性計(jì)算：

a. 用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

（1） 按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每mg 組織蛋白每分鐘生成 1 nmol NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。

NAD-ME（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V 樣×Cpr) ÷T= 3617×ΔA÷Cpr

此法需要自行測(cè)定樣本蛋白質(zhì)濃度。

（2） 按樣本鮮重計(jì)算：

單位的定義：每g 組織每分鐘生成 1 nmol NADH 定義為一個(gè)酶活力單位,。

NAD-ME（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W× V 樣÷V 樣總) ÷T = 3617×ΔA÷W

（3） 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位的定義：每 1 萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘生成 1 nmol NADH 定義為一個(gè)酶活力單位,。

NAD-ME（nmol/min/10⁴ cell）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V 樣÷V 樣總) ÷T =7.234×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積，2.25×10^-4 L,；ε：NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L / mol /cm,；d：比色皿光徑,， 1cm；V 樣：加入樣本體積,，0.01 ml,；V 樣總：加入提取液體積，1 ml,；T：反應(yīng)時(shí)間,，1 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度,，mg/ml,；W：樣本質(zhì)量，g,；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù),，500 萬。

b. 用 96 孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

（1） 按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每mg 組織蛋白每分鐘生成 1 nmol NADH 定義為一個(gè)酶活力單位,。

NAD-ME（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(Cpr×V 樣) ÷T= 7234×ΔA÷Cpr

此法需要自行測(cè)定樣本蛋白質(zhì)濃度,。

（2） 按樣本鮮重計(jì)算：

單位的定義：每g 組織每分鐘生成 1 nmol NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。

NAD-ME（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V 樣÷V 樣總×W) ÷T = 7234×ΔA÷W

（3） 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位的定義：每 1 萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘生成 1 nmol NADH 定義為一個(gè)酶活力單位,。

NAD-ME（nmol/min/10⁴ cell）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V 樣÷V 樣總×500) ÷T =14.468×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積,，2.25×10^-4 L；ε：NADH 摩爾消光系數(shù),，6.22×10³ L / mol,；d：96 孔板光徑，0.5cm,； V 樣：加入樣本體積,，0.01 ml；V 樣總：加入提取液體積,，1 ml,；T：反應(yīng)時(shí)間，1 min,；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度,，mg/ml；W：樣本質(zhì)量；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù),，500 萬,。