細(xì)胞凋亡過(guò)程常伴隨著明顯的細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化,，比如細(xì)胞凋亡早期,，質(zhì)膜內(nèi)側(cè)的磷脂酰絲氨酸會(huì)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞質(zhì)膜表面；而在凋亡的中后期,，隨著細(xì)胞質(zhì)膜通透性的增大,，一些較大分子的化合物，如碘化丙啶(PI),，便可自由擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞,，將細(xì)胞核染上紅色熒光。

Annexin VPI檢測(cè)法原理

Annexin V是一種鈣依賴性磷脂結(jié)合蛋白,，能與PS高親和力特異性結(jié)合,。它不能透過(guò)完整的細(xì)胞膜，而早期凋亡細(xì)胞的細(xì)胞膜是完好的,，對(duì)PI有拒染性,。但在凋亡中晚期的細(xì)胞和死細(xì)胞，PI能透過(guò)細(xì)胞膜而使細(xì)胞核染上,。因此Annexin V 和PI同時(shí)使用,，可以將凋亡早期的細(xì)胞與其它細(xì)胞區(qū)別開來(lái)。

Annexin VPI凋亡檢測(cè)推薦（李記生物）

[名稱]  流式凋亡檢測(cè)試劑盒

[貨號(hào)]  AC12L033

[規(guī)格]  100T

Annexin VPI檢測(cè)法操作步驟

? 對(duì)照管的設(shè)置

   1,、空白管：誘導(dǎo)凋亡的細(xì)胞不加染料,，用來(lái)調(diào)節(jié)電壓；

   2,、單染管：分別需要只加PI和熒光標(biāo)記的Annexin V兩個(gè)單染管,，用來(lái)調(diào)節(jié)補(bǔ)償；

   3,、實(shí)驗(yàn)管：誘導(dǎo)凋亡的細(xì)胞加本次實(shí)驗(yàn)的所有熒光染料,；

   4、陰性管：正常培養(yǎng)細(xì)胞加入染料,，確認(rèn)細(xì)胞正常狀態(tài),，排除假陽(yáng)性,。

? 懸浮細(xì)胞收集染色

   1、在進(jìn)行完細(xì)胞凋亡刺激后,，離心5分鐘,，棄上清，收集細(xì)胞,，用PBS輕輕重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù),。

   2、取1~5×10^5重懸的細(xì)胞,，離心5分鐘,，棄上清，加入500µl 結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞,。

   3,、加入5µl Annexin V-FITC，輕輕混勻,；再加入5 μL 碘化丙啶,，輕輕混勻。

   4,、室溫避光孵育10分鐘,。可以使用鋁箔進(jìn)行避光,。

   5,、隨即進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)，Annexin V-FITC為綠色熒光,，PI為紅色熒光,。

? 貼壁細(xì)胞收集染色

   1、把細(xì)胞培養(yǎng)液吸出至一合適離心管內(nèi),，PBS洗滌貼壁細(xì)胞一次,，用胰酶細(xì)胞消化液(最好不用含有EDTA)消化細(xì)胞。

   2,、細(xì)胞消化下來(lái)后,，同理懸浮細(xì)胞的操作步驟。

? 上機(jī)檢測(cè)

      染色孵育后,，立即進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)或熒光顯微鏡檢測(cè),。

Annexin VPI流式結(jié)果圖（僅做參考）

圖：流式細(xì)胞儀凋亡檢測(cè)結(jié)果圖

 ? 左上象限(Annexin V-/PI+)：為細(xì)胞碎片、機(jī)械損傷細(xì)胞或其它死細(xì)胞,；Annexin V-/PI+象限中細(xì)胞數(shù)越多,，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可信度就越低，因盡量控制本象限細(xì)胞比例。

 ? 左下象限(Annexin V-/PI-)：為正常的活細(xì)胞,；

 ? 右上象限(Annexin V+/PI+)：為晚期凋亡細(xì)胞或壞死細(xì)胞，細(xì)胞膜損傷的細(xì)胞DNA可被PI著染產(chǎn)生紅色熒光,；

 ? 右下象限(Annexin V+/PI-)：為早期凋亡細(xì)胞,，在細(xì)胞凋亡的早期PI無(wú)法著染，不會(huì)產(chǎn)生紅色熒光信號(hào),。

Annexin VPI檢測(cè)法注意事項(xiàng)

 • 檢測(cè)貼壁細(xì)胞時(shí),，若不好控制消化時(shí)間，建議用Accutase細(xì)胞消化液,，對(duì)細(xì)胞損傷小且不會(huì)改變細(xì)胞膜上PS的分布,。

 • 選擇Annexin-V的熒光染料時(shí)要考慮細(xì)胞的自發(fā)熒光，特別是培養(yǎng)時(shí)間久或藥物處理的細(xì)胞,，一定注意細(xì)胞代謝物藥物本身的熒光,，一般來(lái)說(shuō)細(xì)胞代謝物的自發(fā)熒光會(huì)干擾FITC/PE，所以可建議用Annexin-V APC,，藥物的干擾可查看藥物本身的發(fā)射光譜是否會(huì)對(duì)檢測(cè)選擇的染料有影響,。

 • 細(xì)胞染色完成后，禁止固定,，盡快檢測(cè)完,，可將檢測(cè)管放冰上，可減少外界環(huán)境對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響,。

 • 在做凋亡統(tǒng)計(jì)時(shí)一般指統(tǒng)計(jì)前凋亡,，因?yàn)橹挥星暗蛲霾庞幸饬x，當(dāng)然也有文獻(xiàn)統(tǒng)計(jì)總的凋亡比例（前凋亡和晚期凋亡之和）,，單純的統(tǒng)計(jì)晚期凋亡比例意義不大,。