細胞凋亡過程常伴隨著明顯的細胞形態(tài)學變化,,比如細胞凋亡早期,質(zhì)膜內(nèi)側的磷脂酰絲氨酸會翻轉到細胞質(zhì)膜表面,;而在凋亡的中后期,,隨著細胞質(zhì)膜通透性的增大,一些較大分子的化合物,,如碘化丙啶(PI),,便可自由擴散進入細胞,將細胞核染上紅色熒光,。
Annexin VPI檢測法原理
Annexin V是一種鈣依賴性磷脂結合蛋白,,能與PS高親和力特異性結合,。它不能透過完整的細胞膜,而早期凋亡細胞的細胞膜是完好的,,對PI有拒染性,。但在凋亡中晚期的細胞和死細胞,PI能透過細胞膜而使細胞核染上,。因此Annexin V 和PI同時使用,,可以將凋亡早期的細胞與其它細胞區(qū)別開來。
Annexin VPI凋亡檢測推薦(李記生物)
[名稱] 流式凋亡檢測試劑盒
[貨號] AC12L033
[規(guī)格] 100T
Annexin VPI檢測法操作步驟
? 對照管的設置
1,、空白管:誘導凋亡的細胞不加染料,,用來調(diào)節(jié)電壓;
2,、單染管:分別需要只加PI和熒光標記的Annexin V兩個單染管,,用來調(diào)節(jié)補償;
3,、實驗管:誘導凋亡的細胞加本次實驗的所有熒光染料,;
4、陰性管:正常培養(yǎng)細胞加入染料,,確認細胞正常狀態(tài),,排除假陽性。
? 懸浮細胞收集染色
1,、在進行完細胞凋亡刺激后,,離心5分鐘,棄上清,,收集細胞,,用PBS輕輕重懸細胞并計數(shù)。
2,、取1~5×10^5重懸的細胞,,離心5分鐘,棄上清,,加入500µl 結合液輕輕重懸細胞,。
3、加入5µl Annexin V-FITC,,輕輕混勻,;再加入5 μL 碘化丙啶,輕輕混勻,。
4,、室溫避光孵育10分鐘??梢允褂娩X箔進行避光,。
5,、隨即進行流式細胞儀檢測,Annexin V-FITC為綠色熒光,,PI為紅色熒光,。
? 貼壁細胞收集染色
1、把細胞培養(yǎng)液吸出至一合適離心管內(nèi),,PBS洗滌貼壁細胞一次,,用胰酶細胞消化液(最好不用含有EDTA)消化細胞。
2,、細胞消化下來后,,同理懸浮細胞的操作步驟。
? 上機檢測
染色孵育后,,立即進行流式細胞儀檢測或熒光顯微鏡檢測,。
Annexin VPI流式結果圖(僅做參考)
圖:流式細胞儀凋亡檢測結果圖
? 左上象限(Annexin V-/PI+):為細胞碎片、機械損傷細胞或其它死細胞,;Annexin V-/PI+象限中細胞數(shù)越多,,實驗結果可信度就越低,因盡量控制本象限細胞比例,。
? 左下象限(Annexin V-/PI-):為正常的活細胞,;
? 右上象限(Annexin V+/PI+):為晚期凋亡細胞或壞死細胞,細胞膜損傷的細胞DNA可被PI著染產(chǎn)生紅色熒光,;
? 右下象限(Annexin V+/PI-):為早期凋亡細胞,在細胞凋亡的早期PI無法著染,,不會產(chǎn)生紅色熒光信號,。
Annexin VPI檢測法注意事項
• 檢測貼壁細胞時,若不好控制消化時間,,建議用Accutase細胞消化液,,對細胞損傷小且不會改變細胞膜上PS的分布。
• 選擇Annexin-V的熒光染料時要考慮細胞的自發(fā)熒光,,特別是培養(yǎng)時間久或藥物處理的細胞,,一定注意細胞代謝物藥物本身的熒光,一般來說細胞代謝物的自發(fā)熒光會干擾FITC/PE,,所以可建議用Annexin-V APC,,藥物的干擾可查看藥物本身的發(fā)射光譜是否會對檢測選擇的染料有影響。
• 細胞染色完成后,,禁止固定,,盡快檢測完,可將檢測管放冰上,,可減少外界環(huán)境對檢測結果的影響,。
• 在做凋亡統(tǒng)計時一般指統(tǒng)計前凋亡,,因為只有前凋亡才有意義,當然也有文獻統(tǒng)計總的凋亡比例(前凋亡和晚期凋亡之和),,單純的統(tǒng)計晚期凋亡比例意義不大,。
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