一,、細菌的分離培養(yǎng)

1,、培養(yǎng)基制作的原則和一般步驟

（1）培養(yǎng)基制作的原則  培養(yǎng)基是人工方法將多種物質(zhì)按照各類微生物生長的需要而合成的一種混合營養(yǎng)料,，一般用以分離和培養(yǎng)菌類,。常用的培養(yǎng)基有基礎培養(yǎng)基,、增菌培養(yǎng)基,、選擇培養(yǎng)基,、鑒別培養(yǎng)基等。在制作培養(yǎng)基時應掌握如下原則和要求：

①培養(yǎng)基必須含有細菌生長所需要的營養(yǎng)物質(zhì),。

②必須滅菌,不得含有任何活細菌,。

③培養(yǎng)基的材料和盛培養(yǎng)基的容器上,沒有抑制細菌生長的物質(zhì)。

④所制備培養(yǎng)基應該是透明的,，以便觀察細菌生長性狀和其它代謝活動所產(chǎn)生的變化,。

⑤培養(yǎng)基的酸堿度應該符合細菌的生長要求，多數(shù)細菌生長適宜范圍是弱堿（pH7.1~7.6）,。

（2）培養(yǎng)基制備的一般過程  不同的培養(yǎng)基其制備方法不同,，一般要經(jīng)如下步驟：

①根據(jù)不同的菌類和用途，選擇適宜的培養(yǎng)基,。

②精確稱量各種成分,。

③將各種成分按規(guī)定加熱溶解，調(diào)整pH到適宜的范圍內(nèi),。再加熱煮沸10~15分鐘（注意補加液體的損耗）

④過濾（用濾袋或紗布棉花）,，分裝、滅菌（不同的培養(yǎng)基的滅菌溫度和時間不同,，通常為15磅壓力下15~30分鐘）

⑤培養(yǎng)基中的某些成分,，象血清,、腹水、糖類,、尿素,、氨基酸、酶等,，在高溫下易分解,，變性，故應用濾菌器過濾,，再按規(guī)定的溫度和量加入培養(yǎng)基中,。

⑥無菌檢驗，取作好的培養(yǎng)基數(shù)管,，置37℃恒溫箱內(nèi)24小時,，若無細菌和霉菌生長即可使用。

2,、細菌的分離培養(yǎng)

在細菌學診斷中,，細菌的分離培養(yǎng)是的一環(huán)，分離培養(yǎng)的目的是在病料中由多種細菌里挑選出可疑菌,。在分離培養(yǎng)之前,，首先應該注意下列事項：

（1）選擇適合于所含分離細菌生長的培養(yǎng)基。

（2）培養(yǎng)溫度一般在37℃,，但應考慮特殊細菌對溫度的要求,。

（3）考慮所分離的細菌是需氧性或厭氧性，進一步?jīng)Q定培養(yǎng)條件,。

（4）初步分離時發(fā)現(xiàn)有多種細菌,，應進一步選擇可疑菌落進行純培養(yǎng)

二、細菌的接種

1,、平板劃線法  此法為常用的細菌分離培養(yǎng)法,。平板劃線培養(yǎng)的方法甚多，可按各人的習慣選擇應用,，其目的都是將被檢材料作適當?shù)南♂?，以求獲得獨立單在的菌落，防止發(fā)育成菌苔,，以致不易鑒別其菌落性狀,。劃線培養(yǎng)時須注意以下幾點：

（1）左手持皿，用左手拇指,，食指及中指將皿蓋揭開成20度左右的角度（角度愈小愈好,，以免空氣中的細菌進入皿中將培養(yǎng)基污染）。

（2）右手持接種環(huán)，將材料少許涂布于培養(yǎng)基邊緣,，然后將接種環(huán)上多余的材料在火焰中燒毀,，待接種環(huán)冷卻后，再與涂材料之處輕輕接觸,，開始劃線,。

（3）劃線時先將接種環(huán)稍稍彎曲，這易和平皿內(nèi)瓊脂平行,，不致劃破培養(yǎng)基,。

（4）劃線中不宜過多地重復舊線，以免形成菌苔,。

（5）平皿蓋向下,，在培養(yǎng)皿上標注樣品名稱,、編號,、接種日期后，置溫箱中培養(yǎng),。

2,、斜面接種法

3、液體培養(yǎng)基接種法

三,、細菌培養(yǎng)性狀觀察

1,、細菌在液體培養(yǎng)基中生長性狀觀察

（1）渾濁度  觀察是否透明，輕度渾濁,，中度渾濁或極度渾濁,，還有均勻渾濁，顆粒狀渾濁,，絮狀渾濁,。

（2）沉淀  試管底有無沉淀，沉淀物呈顆粒狀,，粘稠狀或絮狀,。輕搖時云霧狀，絮狀或發(fā)辮狀開起,。

（3）表面  有無菌膜及附著于管壁的菌環(huán),。

（4）色素及氣味

2、細菌在固體培養(yǎng)基上菌落生長性狀觀察

（1）大小  各種細菌菌落大小差異很大,，菌落直徑在1毫米以下為露滴狀菌落,；1~2毫米為小菌落；2~4毫米為中等大菌落,；4~6毫米或更大為大菌落,。

（2）形狀  有圓形、規(guī)則形,、根足形,、菌絲狀等,。

（3）邊緣  有整齊、鋸齒狀,、纖毛狀,、卷發(fā)狀等。

（4）表面  有光滑,、濕滑,、粗糙、顆粒狀,、皺絲狀,、同心狀、放射狀等,。

（5）降起度  有角平,、隆起、臍狀,、扭扣狀,。

（6）顏色  有無色、白色,、灰白色,、金黃色、檸檬色,、綠色,、紅色等。

（7）透明度 有透明,、半透明,、不透明等。

四,、顯微鏡檢查——細菌抹片制備,、染色及鏡檢

細菌細胞微小，無色而半透明,，原樣直接在普通光學顯微鏡下觀察,，只能大致見到其外貌,，制成抹片和染色之后,，則能較清楚地顯示其形態(tài)和特殊構造，也可以根據(jù)不同的染色反應,，作為鑒別細菌的一種依據(jù),。

常應用各種染料對細菌進行染色，由于毛細管、滲透,、吸附和吸收等物理作用,，以及離子交換，酸堿等化學作用,，染料就能使細菌著色,，且因細菌細胞的結(jié)構和化學成分不同，而含有不同的染色反應,。

1,、細菌抹片的制備

進行細菌染色之前，須先作好細菌抹片,，其方法如下：

（1）玻片準備  載玻片應清晰透明,、潔凈而無油漬，滴上水后,，能均勻展開,，附著性好。如有油漬,，可按下列方法處理：

①滴上95%酒精2~3滴,，用潔凈紗布揩擦，然后在酒精燈火焰上輕輕拖過幾次,。

②若上法仍未能去除油漬，可再滴上1~2滴冰醋酸,，用紗布擦凈,，再在酒精燈火焰上輕輕通過。

（2）抹片  所用材料情況不同,，抹片方法亦有差異,。

液體材料（如液體培養(yǎng)物、血液,、滲出液,、乳汁等）可直接用滅菌接種環(huán)取一環(huán)材料，于玻片的均勻地涂布成適當大小的薄層,。

不是液體材料（如菌落,、膿、糞便等）則應先用滅菌接種環(huán)取少量生理鹽水或蒸餾水,，置于玻片,，然后再用滅菌接種環(huán)取少量材料，在液滴中混合,，均勻涂布成適當大小的薄層,。

組織臟器材料，先用鑷子夾持局部，然后以滅菌或潔凈剪刀取一小塊,，夾出后將其新鮮切面在玻片上壓積或涂抹成一薄片,。

如有多個樣品同時需要制成抹片，只要染色方法相同,，亦可以在同一張玻片上有秩序地排好,，作多點涂抹，或者先用蠟筆在玻片上劃分成若干小方格,，每方格涂抹一種樣品,，需要保留標本片，應貼標簽,，注明菌名,、材料、染色方法和制片日期等,。

（3）干燥  上述涂片,，應讓其自然干燥。

（4）固定  有兩類固定方法,。

①火焰固定  將干燥好的抹片,，使涂抹面向上，以其背面在酒精燈火焰上來回通過數(shù)次,，略作加熱（但不能太熱,，以不燙手背為度）進行固定。

②化學固定  血液,、組織臟器等抹片要作姬姆薩（Giemsa）染色,，不用火焰固定，而應用甲醇固定,，可將已干燥的抹片浸入甲醇中2~3 分鐘,，取出晾干；或者在抹片上滴加數(shù)滴甲醇使其作用2~3分鐘后,，自然揮發(fā)干燥,。抹片如作瑞特氏染色（Wright’s stain），則必先須作特別固定,，染料中含有甲醇,，可以達到固定的目的。

將抹片固定的目的有如下幾種：

①除去抹片的水分,，涂抹材料能很好地貼附玻片,，以免水洗時易被沖掉

②使抹片易于著色或更好地著色，因為死的蛋白質(zhì)比活的蛋白質(zhì)著色力較強,。

③可能殺死抹片中的微生物,。

必須注意：在抹片固定過程中,，實際上并不能保證殺死全部細菌，也不能避免在染色水洗時不將部分抹片沖脫,。因此,，在制備烈性病原菌，特別是帶芽孢的病原菌的染色抹片時,，應嚴格慎重處理染色用過殘液和抹片本身,，以免引起病原的散播。

固定好的抹片,，即可進行各種方法的染色,。

2、幾種常用染色方法

常用的細菌染色方法,，主要有兩種類型：

（1）簡單染色法  只應用一種染料進行染色的方法,，如美藍染色法。

（2）復染色法   應用兩種或兩種以上的染料或再加媒染劑進行染色的方法,。染色時,，有些是將染料分別先后使用，有些則同時混合使用,。染色后不同的細菌和物體,，或者細菌構造的不同部分可以呈現(xiàn)不同的顏色，有鑒別細菌的作用,，又可稱為鑒別染色,，如革蘭氏染色法、抗酸性染色法,、瑞特氏染色法和姬姆薩染色法,。

①美藍染色法  在已干燥、固定好的抹片上,，滴加適量的（足夠覆蓋涂抹點即可）美藍染色液，經(jīng)1~3分鐘,，水洗,，干燥（可用吸水紙吸干，或自然干燥,，但不能烤干）,，鏡檢。

②革蘭氏染色法

A．在已干燥,、固定好的抹片上,，滴加草酸銨結(jié)晶紫染色液，經(jīng)1~2 分鐘,，水洗,。

B．加革蘭氏碘溶液于抹片上媒染,，作用1~2 分鐘，水洗,。

C．加95%酒精于抹片上脫色,，約0.5~1 分鐘，水洗,。

D．加稀釋石炭酸復紅（或沙黃水溶液）復染10~30秒,，水洗。

E．吸干或自然干燥,，鏡檢,。革蘭氏陽性菌呈藍紫色，革蘭氏陰性菌呈紅色,。

③ 抗酸染色法

A．萋一尼（Ziehl-Neelsen）氏抗酸染色法  首先在已干燥,、固定好的抹片上，滴加較多量的石炭酸復紅染色液,，在玻片下以酒精燈火焰微微加熱至發(fā)生蒸氣為度（不要煮沸）,，維持微微發(fā)生蒸氣，經(jīng)3~5分鐘,，水洗,。然后用3%鹽酸酒精脫色，至標本紅色脫出為止,，充分水洗,。再用堿性美蘭染色液復染約1分鐘，水洗,。最后吸干,，鏡檢?？顾嵝约毦始t色,，非抗酸細菌呈藍色。

B．又法之一：將固定后的抹片滴加金（Kinyoun）氏石炭酸復紅液,，歷3 分鐘,。此液配法為：

堿性復紅              4克        95%乙醇        20毫升

石炭酸（化學純）     9毫升        蒸餾水        100毫升

溶堿性復紅于酒精，再緩緩加水并搖振,，再加入石炭酸混合,。

連續(xù)水洗1.5分鐘后滴加加鮑脫（Gabbott）氏復染液歷1分鐘。此液配法為：

美藍             4克           無水乙醇          20毫升

濃硫酸         20毫升            蒸餾水           50毫升

先將美藍溶于乙醇,，再加蒸餾水,，再加硫酸。

連續(xù)水洗1 分鐘,，吸干,，鏡檢,。抗酸菌呈紅色,，其他菌呈藍色,。

C.又法之二：滴加石炭酸復紅液于抹片（已干燥固定過的）上染1 分鐘；水洗,；再用1%美藍酒精溶液復染20秒,；水洗，干燥,，鏡檢,。抗酸菌紅色,。

鏡檢前對光檢查染色片,，標本片務必全呈藍色。如標本片呈現(xiàn)紅色或棕色,，表示復染不足,，應再作復染5~10 秒，再觀察,。如仍未全呈藍色時,，仍可反復復染，至符合要求為止,。

④ 瑞氏染色法

方法一：抹片自然干燥后,，滴加瑞特氏染色液于其上，為了避免很快變干,，染色液可稍多加些,，或者看情況補充滴加，經(jīng)1~3分鐘,，再加約與染液等量的中性蒸餾水或緩沖液,，輕輕晃動玻片，使與染液混勻,，經(jīng)5分鐘左右,，直接用水沖洗（不可先將染液傾去），吸干或烘干,，鏡檢。細菌染成藍色,，組織,、細胞等物呈其他顏色。

方法二：抹片自然干燥后,，按涂抹點大小,，蓋上一塊略大的清潔濾紙片,，在其上輕輕滴加染色液，至略浸過濾紙,，并看情況補滴,，維持不使變干；染色3~5分鐘鐘,，直接以水沖洗,，吸干或烘干，鏡檢,。此法的染色液經(jīng)濾紙濾過,，可大大避免沉渣粘附抹片上而影響鏡檢觀察。

⑤ 姬姆薩氏染色法

A.于5毫升新煮過的中性蒸餾水中滴加5~10滴姬姆薩染色液原液,，即稀釋成 常用的姬姆薩染色液,。

B.抹片經(jīng)甲醇固定并干燥后，在其上滴加足量染色液或?qū)⒛ㄆ胧⒂腥旧旱娜旧字?，染?0分鐘,，或者染色數(shù)小時至24小時，取出水洗,，吸干或烘干,，鏡檢。細菌呈藍青色,，組織,、細胞等呈其他顏色，視野常呈紅色,。

3,、細菌基本形態(tài)及構造的觀察

（1）細菌的形態(tài)

①球菌：

雙球菌：注意其成雙的排列，兩個菌體接觸面的形狀以及菌體的形態(tài),。

鏈球菌：注意其鏈狀排列,，鏈的長短，個體的形態(tài),。

四聯(lián)球菌：注意其四個聯(lián)結(jié)成方形排列的形態(tài),。

八疊球菌：注意其八個堆疊一起，呈立體方形的形態(tài),。

葡萄球菌：注意其無一定次序,，無一定數(shù)目，不規(guī)則地堆在一起的形態(tài),。

②桿菌：

單桿菌：注意其單個散在的狀態(tài),，菌體外形、大小,、菌端的形狀,。

雙桿菌：注意其成雙的排列以及菌體外形,、大小、菌端的形狀,。

鏈桿菌：注意其成鏈狀排列,，鏈的長短，菌體外形,、大小,、菌端的形狀。

③螺旋狀菌：

弧菌：注意其彎曲成弧形以及菌體大小,，菌端的形狀,。

螺菌：注意其具有兩個彎曲以上的螺旋狀及菌體的長度、大小,，菌端的形狀,。

（2）細菌的一些構造

①莢膜：注意莢膜的位置、形狀,、大小,、染色及相互間的聯(lián)結(jié)。

②鞭毛：注意鞭毛的形狀,、長度,、大小、數(shù)目及其在菌體上的排列（單毛,、叢毛,、周毛）。

③芽孢：注意芽孢的形狀,，與菌體相比的大小以及在菌體中的位置（偏端,、末端）。

④異染顆粒：注意其與菌體不同的染色反應,、形狀,、大小、多少,、位置等,。

五、動物試驗

為了作細菌或其它微生物的分離鑒定,，致病力測定等,，常用實驗動物進行接種，常用的實驗動物接種方法有下列數(shù)種,。

1,、皮下接種

（1）家兔皮下接種  由助手把兔伏臥或仰臥保定，于其背側(cè)或腹側(cè)皮下結(jié)締組織疏松部分剪毛消毒，術者右手持注射器,，以左手拇指、指食和中指捏起皮膚使成一個三角形皺褶,，于其底部進針,，感到針頭可隨意撥動即表示插入皮下。當壓入注射物時感到流利暢通也表示在皮下,。拔出注射針頭時用消毒棉球壓住針孔并稍加按摩,。

（2）豚鼠皮下接種  保定和術式同家兔。

（3）小白鼠皮下注射  作小白鼠皮下注射接種無須助手幫助保定,。術者在做好接種準備后,，以右手捏取鼠尾，此時鼠頭會向前掙扎而可以緊牽其尾,，然后用左手的拇指和食指捏住其兩耳及其頭頸部皮膚使其翻轉(zhuǎn),，背部皮膚固定于左手中指、無名指及拇指基部之間,，以小指壓住其尾根,，小白鼠即仰臥保定于左手上。右手操作局部消毒,，把持注射器,，以針頭稍微挑起皮膚插入皮下，注入時見有水泡微微鼓起即表示注入皮下,。拔出針頭后,，同家兔皮下注射時一樣處理。

2,、皮內(nèi)接種  作家兔,、豚鼠及小白鼠的皮內(nèi)接種時，均需助手保定動物,，其保定方法與皮下接種相同,。接種時術者以左手拇指及食指夾起皮膚，右手持注射器,，針頭要很細,，針頭插入拇指與食指之間的皮膚內(nèi)，針頭插入不宜過深,，同時針頭插入角度要小,，即與夾起的皮膚平行，注射時感到有阻力且注射完畢后皮膚上有小硬皰即為注入皮內(nèi)的表現(xiàn),。皮內(nèi)接種要慢,，否則容易使皮膚脹裂或自針孔流出注射物而散播傳染。

3、腹腔內(nèi)接種  在家兔,、豚鼠及小白鼠的腹腔接種,，宜采取仰臥保定。接種時其后軀應稍抬高使其內(nèi)臟傾向前腔,，接種部位在腹后側(cè)面,，針頭先插入皮下，后進入腹腔,，注射后皮膚應無皰隆起,。其余術式同于皮下接種法。

4,、靜脈注射

（1）家兔的靜脈注射  將家兔納入保定器內(nèi)或由助手保定兔體露出其頭,。選一側(cè)耳邊緣靜脈，助手以拇指及食指緊壓耳根部,，使靜脈努張,，術者剪去靜脈管上皮膚的毛，消毒局部,，若需對同一動物作多次接種時,，應自接近耳尖初處開始刺入接種，以后逐次接近耳根,。接種時術者左手執(zhí)兔耳,，右手持針（針頭不宜太細），以與靜脈平行方向刺入靜脈,，同時助手放松其緊壓手指,，以便血液流通。注射時無阻力且有血向前流即表示注入靜脈,。緩緩注射,，注射完針頭拔出后，用消毒棉球緊壓針孔片刻,，以免流血或注射物溢出,。

（2）豚鼠靜脈內(nèi)接種  豚鼠靜脈內(nèi)接種比較困難，因為豚鼠沒有裸露明顯的靜脈可尋,，若必須作注射時,，使豚鼠伏臥保定，腹面向下,，將其后肢剃毛,，用70%酒精消毒皮膚，施以全身麻醉,，用銳利刀片向后肢內(nèi)上側(cè)向外下方切一長約一厘米的切口,，使露出皮下靜脈，用最小號針頭（26號），刺入靜脈慢慢注入接種物,。接種完畢,，皮膚應縫合一兩針。

（3）小白鼠靜脈接種  作小白鼠靜脈內(nèi)接種時,，選尾側(cè)靜脈,，體重在15~20克為宜。因其尾部皮膚比較柔軟,、菲薄，靜脈管清晰可見,，若體重在20克以上時,，尾部皮膚較厚、較硬,，對缺乏經(jīng)驗的人更難于注射好,。接種時用一玻璃杯扣住小白鼠，露出尾部,，用最小號針頭刺入尾側(cè)靜脈,，緩緩注入接種物，注射時無阻力,，皮膚不變白,、不隆起，表示注入到靜脈內(nèi),。

5,、腦內(nèi)接種法  作病毒學實驗研究時，有時用腦內(nèi)接種法,，通常多用小白鼠,，特別是乳鼠（1~3日齡），接種時通常使小白鼠以作輕度麻醉,，用碘酒消毒其顱部毛皮再以酒精棉球拭去碘液,，用1毫升結(jié)核菌素注射器，以最小號針頭吸取接種,，于兩耳根連接線中點略偏左（或右）處,，以皮膚及顱骨稍向下刺入少許即可，注射完畢拔出針頭,，以棉球壓住針孔片刻,。接種乳鼠時一般不麻醉，不用碘酒,。       

北京百歐博偉生物技術有限公司擁有Biolog微生物鑒定系統(tǒng),，超低溫冰箱，生物安全柜等儀器設備可進行對微生物分離、鑒定等常規(guī)的分子實驗研究,。對我國生命科學研究,、生物技術創(chuàng)新和產(chǎn)業(yè)發(fā)展的需求進行積極的面對社會乃至國外收集保藏提供微生物菌種資源。在保證生物安全和保護知識產(chǎn)權的前提下,，為工農(nóng)業(yè)生產(chǎn),、衛(wèi)生健康、環(huán)境保護,、科研教育提供微生物物種資源,、基因資源、信息資源和專業(yè)技術服務,。

除此之外,，我們還擁有對菌種、細胞,、培養(yǎng)基,、配套試劑等產(chǎn)品需求者的極優(yōu)質(zhì)服務，對購買項目的前期資料提供,中期合同保證,后期貨物跟蹤到最終售后的確保項目準確到位,，都有相關人士進行維護,確保您在微生物菌種查詢網(wǎng)中獲得優(yōu)質(zhì)服務,！也正因為此，北京百歐博偉生物技術有限公司與國內(nèi)外多家研制單位,、生物制藥,、第三方檢測機構和科研院所院校、化工企業(yè)有著良好,、長期和穩(wěn)定的合作關系,！