一,、質(zhì)粒

質(zhì)粒是一種環(huán)狀的小分子 DNA，是進(jìn)行 DNA 重組的常用載體,，在分子生物學(xué)研究和基因治療中對(duì)于質(zhì)粒的產(chǎn)量和質(zhì)量都有一定的要求,，其中超螺旋比例和內(nèi)毒素含量是影響質(zhì)粒質(zhì)量的兩個(gè)重要因素。

雖然超螺旋通常是主要形式,，但在所有質(zhì)粒制備中,，切口和線性DNA形式通常作為次要形式回收。

但是,，如果操作不當(dāng)?shù)脑?，超螺旋形式?/span>DNA質(zhì)粒的收獲率可能不高，那么如何提高質(zhì)粒DNA的超螺旋比例呢,？

二,、提高質(zhì)粒超螺旋比例的方法

（1）在生長(zhǎng)平臺(tái)期收獲細(xì)菌培養(yǎng)物

在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)過(guò)程中過(guò)早收獲細(xì)菌時(shí)，經(jīng)常會(huì)看到帶切口的 DNA,。為避免分離出大量帶切口的DNA,，建議收獲進(jìn)入生長(zhǎng)平臺(tái)期（生長(zhǎng)12-16小時(shí)后）的細(xì)菌。

（2）不要渦旋和輕輕移液

如果在質(zhì)粒分離過(guò)程中將制備物渦旋或過(guò)度劇烈搖晃,，則可能會(huì)因DNA的機(jī)械剪切而出現(xiàn)切口或線性DNA,。所以建議輕輕混合,，不要渦旋，輕輕少量地移液,。

（3）切勿過(guò)度使用堿性裂解液

堿性裂解是從基因組DNA中分離質(zhì)粒DNA關(guān)鍵步驟,，但如果過(guò)度使用，則可能通過(guò)將質(zhì)粒長(zhǎng)久變性為單鏈環(huán)狀形式來(lái)長(zhǎng)久破壞質(zhì)粒的超螺旋,。所以建議將裂解的孵育時(shí)間保持在推薦的時(shí)間,，并在此步驟中非常輕柔地混合。

（4）小心處理質(zhì)粒重懸液

風(fēng)干后質(zhì)粒重懸期間可能會(huì)發(fā)生剪切,。質(zhì)粒越大,，發(fā)生剪切的可能性就越大。沉淀后輕柔處理制備物,，讓DNA吸收到水中,，而不是劇烈吹打。

（5）避免核酸內(nèi)切酶

某些細(xì)菌菌株含有核酸內(nèi)切酶A（endA+）,，可以線性化DNA,。建議將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到endA–菌株中，則盡可能高效地進(jìn)行質(zhì)粒制備,，以快速將DNA從酶中移開(kāi),。

（6）保持低溫

有研究表明在較低溫度（4-12°C）下執(zhí)行所有步驟會(huì)增加回收的超螺旋質(zhì)粒的量

三、舉例

如圖所示,，質(zhì)粒提取之后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,，開(kāi)環(huán)質(zhì)粒的占比約20%，說(shuō)明超螺旋比例低,，一般超螺旋比例需要＞90%,，一般來(lái)說(shuō)超螺旋比例越高，質(zhì)粒的穩(wěn)定性越高,，高超螺旋比例的質(zhì)粒在轉(zhuǎn)染效率,、基因表達(dá)水平等方面具有更好的表現(xiàn)。

原因：裂解時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng),，加入裂解液后裂解時(shí)間不應(yīng)超過(guò)5分鐘,，以免質(zhì)粒受到破壞

解決方法：優(yōu)化裂解時(shí)間；確保質(zhì)粒的結(jié)合和所有溶液都在室溫下進(jìn)行,，減少離心力對(duì)質(zhì)粒超螺旋結(jié)構(gòu)的影響,，因?yàn)檫^(guò)度的離心可能會(huì)破壞質(zhì)粒的超螺旋結(jié)構(gòu)。

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