斑馬魚17α,，20β-雙羥孕酮(17α，20β-DHP)ELISA檢測試劑盒

使用說明書

檢測范圍

0.625ng/ml--20ng/ml

檢測原理

本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測定標(biāo)本中斑馬魚17α,，20β-雙羥孕酮(17α,，20β-DHP)水平。用純化的斑馬魚17α,，20β-雙羥孕酮(17α,，20β-DHP)捕獲抗體包被微孔板，制成固相抗體,，往包被的微孔中依次加入斑馬魚17α,，20β-雙羥孕酮(17α，20β-DHP),，再與HRP標(biāo)記的檢測抗體結(jié)合,，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過洗滌后加底物TMB顯色,。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色,，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的斑馬魚17α,，20β-雙羥孕酮(17α,，20β-DHP)呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度（OD值）,，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中斑馬魚17α,，20β-雙羥孕酮(17α，20β-DHP)含量,。

樣品收集,、處理及保存方法

1.  血清：使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管，操作過程中避免任何細(xì)胞刺激,，收集血液后,，3000轉(zhuǎn)離心10分鐘將血清和紅細(xì)胞迅速小心地分離,。

2.  血漿：EDTA、檸檬酸鹽或肝素抗凝,。3000轉(zhuǎn)離心30分鐘取上清,。

3.  細(xì)胞上清液：3000轉(zhuǎn)離心10分鐘去除顆粒和聚合物。

4.  組織勻漿：將組織加入適量生理鹽水搗碎,。3000轉(zhuǎn)離心10分鐘取上清,。

5.  保存：如果樣本收集后不及時檢測，請按一次用量分裝,，凍存于-20℃,，避免反復(fù)凍融，在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍,。

自備物品

酶標(biāo)儀（450nm）

高精度加樣器及槍頭：0.5-10uL,、2-20uL、20-200uL,、200-1000uL

37℃恒溫箱

蒸餾水或去離子水

操作注意事項

嚴(yán)格按照規(guī)定的時間和溫度進行溫育以保證準(zhǔn)確結(jié)果,。所有試劑都必須在使用前達到室溫20-25℃。使用后立即冷藏保存試劑,。

洗板不正確可以導(dǎo)致不準(zhǔn)確的結(jié)果,。在加入底物前確保盡量吸干孔內(nèi)液體。溫育過程中不要讓微孔干燥掉,。

消除板底殘留的液體和手指印,，否則影響OD值,。

底物顯色液應(yīng)呈無色或很淺的顏色，已經(jīng)變藍的底物液不能使用。

避免試劑和標(biāo)本的交叉污染以免造成錯誤結(jié)果,。

在儲存和溫育時避免強光直接照射,。

平衡至室溫后再打開密封袋以防水滴凝聚在冷板條上,。

任何反應(yīng)試劑不能接觸漂白溶劑或漂白溶劑所散發(fā)的強烈氣體,。任何漂白成分都會破壞試劑盒中反應(yīng)試劑的生物活性。

不能使用過期產(chǎn)品,。

如果可能傳播疾病,，所有的樣品都應(yīng)管理好，按照規(guī)定的程序處理樣品和檢測裝置,。

試劑盒組成

備注：

1.  標(biāo)準(zhǔn)品濃度依次為：20,、10、5,、2.5,、1.25、0.625ng/ml.

2.  經(jīng)過大量正常標(biāo)本檢驗,，標(biāo)本的正常濃度值均在試劑盒提供的檢測范圍內(nèi),，實驗過程中直接取50μL樣本上樣即可。當(dāng)有部分樣本值超過最大標(biāo)準(zhǔn)品濃度時,，可用樣本稀釋液將標(biāo)本進行適當(dāng)稀釋后再進行實驗,。

試劑的準(zhǔn)備

試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡后方可使用。20×洗滌緩沖液的稀釋：蒸餾水按1：20稀釋,，即1份20×洗滌緩沖液加19份蒸餾水,。

洗板方法

手工洗板：甩盡孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液,，靜置1min后甩盡孔內(nèi)液體,，在吸水紙上拍干，如此洗板5次,。  自動洗板機：每孔注入洗液350μL,，浸泡1min，洗板5次,。

操作步驟

  從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條,，剩余板條用自封袋密封放回4℃。

  設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔,，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μL,；

  樣本孔中加入待測樣本50μL；空白孔不加,。

  除空白孔外,，標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的檢測抗體100μL，用封板膜封住反應(yīng)孔,，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min,。

  棄去液體，吸水紙上拍干,，每孔加滿洗滌液（350μL）,，靜置1min，甩去洗滌液,，吸水紙上拍干,，如此重復(fù)洗板5次（也可用洗板機洗板）。

  每孔加入底物A,、B各50μL,，37℃避光孵育15min。

  每孔加入終止液50μL,，15min內(nèi),，在450nm波長處測定各孔的OD值。

結(jié)果判斷

 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：在Excel工作表中,，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度作橫坐標(biāo),，對應(yīng)OD值作縱坐標(biāo),，繪制出標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸曲線，按曲線方程計算各樣本濃度值,。