細胞凍存是細胞保存的主要方法之一,。利用凍存技術(shù)將細胞置于一196~C液氮中低溫保存，可以使細胞暫時脫離生長狀態(tài)而將其細胞特性保存起來,，這樣在需要的時候再復(fù)蘇細胞用于實驗,。而且適度地保存一定量的細胞，可以防止因正在培養(yǎng)的細胞被污染或其他意外事件而使細胞丟種,，起到了細胞保種的作用,。除此之外，還可以利用細胞凍存的形式來購買,、寄贈,、交換和運送某些細胞,。 細胞凍存時向培養(yǎng)基中加入保護劑--終濃度5％．15％的甘油或二甲基亞砜（DMSO），可使溶液冰點降低,，加之在緩慢凍結(jié)條件下,，細胞內(nèi)水分透出，減少了冰晶形成,，從而避免細胞損傷,。 采用"慢凍快融"的方法能較好地保證細胞存活。標準冷凍速度開始為-1 到 -2℃／min,，當溫度低于-25℃時可加速,，到-80℃之后可直接投入液氮內(nèi)（-196℃）。復(fù)蘇細胞時則直接將裝有細胞的凍存管投入40℃熱水中迅速解凍,。

材料：凍存管,，離心管，細胞培養(yǎng)用材料,，500 mL燒杯,，膠布，搪瓷杯,，75％酒精棉,。

藥品：培養(yǎng)基（RPMI1640或DMEM），小牛血清,，0．25％胰蛋白酶溶液,，二甲基亞砜（DMSO）或甘油，0．5％臺盼藍染液,，液氮,。

儀器：4℃冰箱，-70℃冰箱,，液氮容器,，微量加樣器，水浴鍋,，離心機,。

（一）細胞凍存

1．取待凍存的細胞用胰酶消化（見相關(guān)實驗細胞傳代培養(yǎng)部分），用培養(yǎng)基將細胞沖洗下來,。800 r/min離心5 min,，棄上清收集細胞。如果是懸浮生長的細胞,，則可直接離心收集細胞,。

2．加入適量凍存液（10％甘油+90％培養(yǎng)基，或者10％DMSO+90％培養(yǎng)基）制成細胞懸液,。細胞濃度宜大,，3×106個／mL左右,，并可適量增加牛血清濃度至20％。

3．細胞懸液裝入凍存管中,。用膠布封裹,，做好標記（寫上細胞種類、時間及凍存條件等）,。

4．凍存管在4℃下存放30 min,，轉(zhuǎn)放-20℃ 1.5～2 h，再轉(zhuǎn)人-70℃ 4-12 h后即可轉(zhuǎn)移到液氮內(nèi)（-196℃）,，注意進行登記,。

（二）細胞復(fù)蘇

1．取一搪瓷杯盛上適量自來水加熱至40℃左右。

2．從液氮中取出凍存管立即投人40℃水中迅速解凍,。

3．取出凍存管,，用75％酒精清潔管口，打開,。

4．離心去上清收集細胞,，用無血清培養(yǎng)基洗1次，加人3 mL新鮮培養(yǎng)基,，于小培養(yǎng)瓶中培養(yǎng),。

5．每日觀察細胞生長情況，如果死細胞較多,，復(fù)蘇次日應(yīng)換液,。待細胞長滿后可進行傳代培養(yǎng)。