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動物細胞培養(yǎng):細胞凍存與復(fù)蘇

來源:上海邦奕商貿(mào)有限公司   2012年06月07日 17:42  

 細胞凍存是細胞保存的主要方法之一,。利用凍存技術(shù)將細胞置于一196~C液氮中低溫保存,可以使細胞暫時脫離生長狀態(tài)而將其細胞特性保存起來,,這樣在需要的時候再復(fù)蘇細胞用于實驗,。而且適度地保存一定量的細胞,可以防止因正在培養(yǎng)的細胞被污染或其他意外事件而使細胞丟種,,起到了細胞保種的作用,。除此之外,還可以利用細胞凍存的形式來購買,、寄贈,、交換和運送某些細胞,。 細胞凍存時向培養(yǎng)基中加入保護劑--終濃度5%.15%的甘油或二甲基亞砜(DMSO),可使溶液冰點降低,,加之在緩慢凍結(jié)條件下,,細胞內(nèi)水分透出,減少了冰晶形成,,從而避免細胞損傷,。 采用"慢凍快融"的方法能較好地保證細胞存活。標準冷凍速度開始為-1 到 -2℃/min,,當溫度低于-25℃時可加速,,到-80℃之后可直接投入液氮內(nèi)(-196℃)。復(fù)蘇細胞時則直接將裝有細胞的凍存管投入40℃熱水中迅速解凍,。

材料:凍存管,,離心管,細胞培養(yǎng)用材料,,500 mL燒杯,,膠布,搪瓷杯,,75%酒精棉,。

藥品:培養(yǎng)基(RPMI1640或DMEM),小牛血清,,0.25%胰蛋白酶溶液,,二甲基亞砜(DMSO)或甘油,0.5%臺盼藍染液,,液氮,。

儀器:4℃冰箱,-70℃冰箱,,液氮容器,,微量加樣器,水浴鍋,,離心機,。

(一)細胞凍存

1.取待凍存的細胞用胰酶消化(見相關(guān)實驗細胞傳代培養(yǎng)部分),用培養(yǎng)基將細胞沖洗下來,。800 r/min離心5 min,,棄上清收集細胞。如果是懸浮生長的細胞,,則可直接離心收集細胞,。

2.加入適量凍存液(10%甘油+90%培養(yǎng)基,或者10%DMSO+90%培養(yǎng)基)制成細胞懸液,。細胞濃度宜大,,3×106個/mL左右,,并可適量增加牛血清濃度至20%。

3.細胞懸液裝入凍存管中,。用膠布封裹,,做好標記(寫上細胞種類、時間及凍存條件等),。

4.凍存管在4℃下存放30 min,,轉(zhuǎn)放-20℃ 1.5~2 h,再轉(zhuǎn)人-70℃ 4-12 h后即可轉(zhuǎn)移到液氮內(nèi)(-196℃),,注意進行登記,。

(二)細胞復(fù)蘇

1.取一搪瓷杯盛上適量自來水加熱至40℃左右。

2.從液氮中取出凍存管立即投人40℃水中迅速解凍,。

3.取出凍存管,,用75%酒精清潔管口,打開,。

4.離心去上清收集細胞,,用無血清培養(yǎng)基洗1次,加人3 mL新鮮培養(yǎng)基,,于小培養(yǎng)瓶中培養(yǎng),。

5.每日觀察細胞生長情況,如果死細胞較多,,復(fù)蘇次日應(yīng)換液,。待細胞長滿后可進行傳代培養(yǎng)。

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