細(xì)胞凍存是細(xì)胞保存的主要方法之一。利用凍存技術(shù)將細(xì)胞置于一196~C液氮中低溫保存,,可以使細(xì)胞暫時(shí)脫離生長狀態(tài)而將其細(xì)胞特性保存起來,,這樣在需要的時(shí)候再復(fù)蘇細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。而且適度地保存一定量的細(xì)胞,,可以防止因正在培養(yǎng)的細(xì)胞被污染或其他意外事件而使細(xì)胞丟種,,起到了細(xì)胞保種的作用。除此之外,,還可以利用細(xì)胞凍存的形式來購買,、寄贈、交換和運(yùn)送某些細(xì)胞,。 細(xì)胞凍存時(shí)向培養(yǎng)基中加入保護(hù)劑--終濃度5%.15%的甘油或二甲基亞砜(DMSO),,可使溶液冰點(diǎn)降低,加之在緩慢凍結(jié)條件下,細(xì)胞內(nèi)水分透出,,減少了冰晶形成,,從而避免細(xì)胞損傷。 采用"慢凍快融"的方法能較好地保證細(xì)胞存活,。標(biāo)準(zhǔn)冷凍速度開始為-1 到 -2℃/min,,當(dāng)溫度低于-25℃時(shí)可加速,到-80℃之后可直接投入液氮內(nèi)(-196℃),。復(fù)蘇細(xì)胞時(shí)則直接將裝有細(xì)胞的凍存管投入40℃熱水中迅速解凍,。
材料:凍存管,離心管,,細(xì)胞培養(yǎng)用材料,,500 mL燒杯,膠布,,搪瓷杯,,75%酒精棉。
藥品:培養(yǎng)基(RPMI1640或DMEM),,小牛血清,,0.25%胰蛋白酶溶液,二甲基亞砜(DMSO)或甘油,,0.5%臺盼藍(lán)染液,,液氮。
儀器:4℃冰箱,,-70℃冰箱,,液氮容器,微量加樣器,,水浴鍋,,離心機(jī)。
(一)細(xì)胞凍存
1.取待凍存的細(xì)胞用胰酶消化(見相關(guān)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞傳代培養(yǎng)部分),,用培養(yǎng)基將細(xì)胞沖洗下來,。800 r/min離心5 min,棄上清收集細(xì)胞,。如果是懸浮生長的細(xì)胞,,則可直接離心收集細(xì)胞。
2.加入適量凍存液(10%甘油+90%培養(yǎng)基,,或者10%DMSO+90%培養(yǎng)基)制成細(xì)胞懸液,。細(xì)胞濃度宜大,3×106個(gè)/mL左右,,并可適量增加牛血清濃度至20%,。
3.細(xì)胞懸液裝入凍存管中,。用膠布封裹,做好標(biāo)記(寫上細(xì)胞種類,、時(shí)間及凍存條件等),。
4.凍存管在4℃下存放30 min,轉(zhuǎn)放-20℃ 1.5~2 h,,再轉(zhuǎn)人-70℃ 4-12 h后即可轉(zhuǎn)移到液氮內(nèi)(-196℃),,注意進(jìn)行登記。
(二)細(xì)胞復(fù)蘇
1.取一搪瓷杯盛上適量自來水加熱至40℃左右,。
2.從液氮中取出凍存管立即投人40℃水中迅速解凍,。
3.取出凍存管,用75%酒精清潔管口,,打開,。
4.離心去上清收集細(xì)胞,用無血清培養(yǎng)基洗1次,,加人3 mL新鮮培養(yǎng)基,,于小培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。
5.每日觀察細(xì)胞生長情況,,如果死細(xì)胞較多,復(fù)蘇次日應(yīng)換液,。待細(xì)胞長滿后可進(jìn)行傳代培養(yǎng),。
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