研究背景：

細胞不斷感知和響應(yīng)微環(huán)境中的生化和生物力學(xué)變化，需要動態(tài)代謝適應(yīng),。細胞外基質(zhì)（ECM）硬化是癌癥侵襲性的標(biāo)志,，而基質(zhì)剝離下的生存

也與不良預(yù)后相關(guān),。細胞通過整合素共軛結(jié)合的焦點附著斑（FAs） 感知ECM的物理特性，影響細胞遷移,、分化和存活,。由于組織纖維化和

ECM硬化與腫瘤預(yù)后不良相關(guān),，通過膠原蛋白消耗或賴氨酸氧化酶（LOX）抑制或藥物改變細胞機械轉(zhuǎn)導(dǎo)來抑制ECM硬化已成為癌癥治療的有希

望的選擇。腫瘤細胞如何在堅硬的基質(zhì)上獲得生長優(yōu)勢,，而在基質(zhì)脫離時抵抗失巢凋亡死亡仍然是一個謎,，其作用機制仍不清楚。

失巢凋亡是一種特殊形式的程序性細胞死亡,。正常貼壁生長的細胞在失去與細胞外基質(zhì)（ECM）的黏附或細胞間相互接觸受到破壞后,，因無法從

周圍環(huán)境中獲得生存信號而啟動的一種細胞凋亡程序。腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移是一個復(fù)雜的多步驟過程,，其中包括腫瘤細胞從原發(fā)腫瘤組織脫離,、侵入

周圍組織、進入血液循環(huán)或淋巴循環(huán),、在遠處器官黏附和定植等環(huán)節(jié),。失巢凋亡在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中起著重要的屏障作用。正常情況下,，脫離原發(fā)

腫瘤組織的腫瘤細胞由于失去了與細胞外基質(zhì)的黏附,，應(yīng)該發(fā)生失巢凋亡而死亡，從而限制了腫瘤細胞的擴散,。然而,，腫瘤細胞往往通過多種方

式逃避失巢凋亡，這使得其能夠在血液循環(huán)中存活并轉(zhuǎn)移到遠端器官,，形成轉(zhuǎn)移灶,。

在本研究中，研究人員詳細介紹了整合素/GSK3 β/FTO/MTOR軸在乳腺癌進展中的作用：乳腺癌細胞通過該信號軸整合剛度感知,，以確保剛性基

質(zhì)賦予的生長優(yōu)勢和基質(zhì)剝離下細胞的抗失巢凋亡能力,。

研究結(jié)果：

1. 基質(zhì)硬化激活mTORC1通路,，促進細胞生長

研究的結(jié)果表明,，在剛性培養(yǎng)條件下，使用mTORC1抑制劑雷帕霉素和/或肌球蛋白II抑制劑blebbistatin抑制細胞收縮力后,，細胞生長顯著降低,。

RNA-Seq的分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)在硬基質(zhì)培養(yǎng)條件下的上調(diào)特征基因富集在mTORC1信號通路。此外,，與軟基質(zhì)相比,，多種細胞在硬基質(zhì)條件下的

phos-S6水平顯著增加，而總S6水平?jīng)]有明顯變化,。同時,，AKT和AMPKα磷酸化水平無顯著差異，這表明mTORC1在硬化條件下激活的特異性,。

為研究FAs是否參與底物剛度誘導(dǎo)的mTORC1激活,，研究人員首先使用免疫熒光染色,，檢測到mTOR/Phos-S6與FA標(biāo)記蛋白paxillin或vinculin在硬

基質(zhì)而不是軟基質(zhì)上的強共定位。而使用blebbistatin干擾硬基質(zhì)培養(yǎng)細胞的細胞收縮性時,，共聚焦和超分辨率STED成像表明mTOR和

phos-S6的特異性FA定位消失,。表明FAs在硬基質(zhì)誘導(dǎo)的mTORC1激活中起關(guān)鍵作用。

此外,，mTOR蛋白質(zhì)水平和mTORC1活性的同時減低只在敲低??1整合蛋白時發(fā)生,。同時，整合素??1的敲低阻礙了mTOR/phos-S6和paxillin在

硬基質(zhì)上的共定位,，并降低了 mTORC1的活性,。這些結(jié)果揭示了整合素??1在基質(zhì)硬度介導(dǎo)的mTORC1激活中的重要作用。

3. 軟基質(zhì)通過調(diào)節(jié)m6A RNA甲基化降低mTOR蛋白豐度

進一步的研究發(fā)現(xiàn)軟基質(zhì)上的細胞或敲低黏著斑蛋白顯著降低mTOR蛋白水平,，而Raptor,、mLST8或DEPDC6豐度無變化。MG132在對照

組中導(dǎo)致mTOR蛋白的積累,。而在blebbistatin處理的細胞中,，這種增加被減弱；這暗示在低收縮力下,，mTOR蛋白的合成可能受到阻礙,，導(dǎo)

致總mTOR降低，而兩組間mTOR降解無明顯差異,。表明在軟基質(zhì)下mTOR水平的下降或收縮力的降低是由于蛋白合成受到抑制而非降解增

強引起的,。

此外，blebbistatin干預(yù)后mTOR mRNA減少,，但熒光素酶報告基因檢測mTOR mRNA轉(zhuǎn)錄能力時,，在blebbistatin干預(yù)后無顯著差異。

相比之下,，使用放線菌素D阻斷 RNA合成并監(jiān)測 mRNA穩(wěn)定性時,， blebbistatin干預(yù)后 mTOR mRNA的降解速度明顯加快。使用SRAMP

軟件在線預(yù)測了位于mTOR mRNA 3'UTR的5個非常高置信度的m6A修飾位點,，在blebbistatin治療后,，Me-RIP qPCR的結(jié)果顯示所有五

個位點都表現(xiàn)出升高的m6A修飾。這些數(shù)據(jù)表明剛性敏感的m6A變化可能介導(dǎo)mTOR蛋白豐度在不同剛度或細胞收縮性條件下的改變,。

4. FTO磷酸化鏈接剛性傳感與mTOR m6A修飾

隨后,，研究人員分析了甲基化酶/去甲基化酶METTL3、METTL14,、WTAP,、VIRMA、FTO和ALKBH5的干擾對硬基質(zhì)和軟基質(zhì)條件下

mTOR和phos-S6蛋白變化的影響。發(fā)現(xiàn)FTO是參與mTOR m6A修飾的去甲基化酶,。RIP-qPCR的結(jié)果表明,，blebbistatin處理的細胞中

mTOR mRNA被FTO富集較對照組減少。表明mTOR mRNA和FTO之間的相互作用可能在低收縮性下被破壞,，留下更多的m6A修飾完整

而沒有有效擦除,。在不同硬度下，FTO的亞細胞定位和蛋白水平均未見明顯變化,，而在blebbistatin處理的細胞中,，FTO泛磷酸化絲氨酸

水平升高，進一步發(fā)現(xiàn)FTO的Ser 256位點磷酸化修飾是FTO調(diào)控mTORC1的關(guān)鍵,。

5. GSK3β定位在FA區(qū)域,，磷酸化FTO激活mTORC1

人類FTO中的重復(fù)共識基序“256S/T- e - dd -S/T(P)260” 與GSK3的底物識別基序 “S/T- x - x - x -S/T(P)”相匹配。實驗表明,，使用CHIR-98014

抑制GSK3β可降低FTO的磷酸化,，而通過降低細胞張力激活FTO則會產(chǎn)生相反的效果；同時發(fā)現(xiàn)CHIR-98014處理軟基質(zhì)培養(yǎng)的細胞后,，

phos-S6水平恢復(fù),。此外，免疫共沉淀的結(jié)果表明,，FTO與GSK3β存在直接結(jié)合,。GSK3的亞細胞定位研究發(fā)現(xiàn)，GSK3在細胞質(zhì)中主要是

彌漫性的,，但在細胞的腹側(cè)顯示斑塊樣結(jié)構(gòu),，與paxillin在FA位點共定位。

而錳離子增加了GSK3的ser9上的磷酸化,；同時,，在硬底物與軟底物上培養(yǎng)的細胞中phos-GSK3 (Ser9)升高，但總GSK3水平?jīng)]有顯著變化,。

這些結(jié)果確定了GSK3在基質(zhì)強度誘導(dǎo)的FTO和mTORC1激活中的潛在作用,，以及其潛在機制可能涉及整合素??1。

6. ECM脫離過程中mTORC1調(diào)節(jié)細胞自噬的作用機制

ECM脫離,，相當(dāng)于一個極其柔軟的基質(zhì),，已被報道誘導(dǎo)代謝應(yīng)激導(dǎo)致失巢凋亡,，自噬可以 保護細胞免受損傷,，促進與ECM的再附著。研究

在低黏附基質(zhì)上培養(yǎng)MDA-MB-231和MEF細胞時,，觀察到LC3B-II水平升高和mTOR及phos-S6水平下降,。表明了自噬水平的升高。

隨后，懸浮MEF較貼壁細胞碘化丙啶（PI）染色率,，而自噬藥理抑制劑氯喹（CQ）的干預(yù)進一步增強了細胞死亡程度,。在雷帕霉素處理

的細胞中，細胞死亡的增強明顯減弱,。通過血清刺激激活mTORC1后,，也觀察到CQ治療對細胞死亡的類似影響。表明基質(zhì)分離能夠通過

抑制mTORC1活性增強自噬,，從而促進細胞對失巢凋亡的抵抗并提高生存率,。此外，在多個腫瘤細胞系中觀察到,，LC3B-II蛋白在硬底物

或高收縮力的細胞中減少,，而在軟底物或低收縮力的細胞中增加；且TEM觀察到低收縮性細胞中自噬體數(shù)量增加,，提示軟基質(zhì)上自噬通量

增強,。另外，TSC2敲除細胞中硬基質(zhì)與軟基質(zhì)上LC3B-II水平的差異減弱,。這表明基質(zhì)硬化以mTORC1依賴的方式阻礙自噬,。最后，

在DCIS患者連續(xù)切片組織樣本中,，與正常乳腺上皮相比,，分離細胞和腔細胞的LC3B水平更高，而分離細胞和腔細胞中相應(yīng)的mTOR 水平

與LC3B呈反相關(guān),。

綜上所述,，研究結(jié)果強調(diào)了細胞代謝的雙相機制調(diào)節(jié)，與腫瘤在纖維化等硬化條件下的生長以及癌癥轉(zhuǎn)移期間的失巢凋亡抗性有關(guān),。

基質(zhì)硬化時可以通過整合素和GSK3β-FTO介導(dǎo)的mRNA m6A修飾激活mTORC1,，提高mTOR水平，促進合成代謝,；在ECM脫離時抑制

該軸增強自噬,，進而抑制失巢凋亡促進細胞存活。

文獻給讀者的啟發(fā)在于揭示剛性感知在腫瘤進展中的作用,，一方面揭示實體瘤細胞生長中的新機制,；另一方面揭示腫瘤轉(zhuǎn)移過程中脫離

基質(zhì)后，腫瘤細胞通過自噬抵抗失巢凋亡促進存活的生存策略,。這種腫瘤細胞對基質(zhì)微環(huán)境的應(yīng)答機制有助于對腫瘤進展的理解和靶向

治療的開發(fā),。