研究背景

ABC轉(zhuǎn)運蛋白（ATP-binding cassette transporter）是一類ATP驅(qū)動泵,，在人類基因組已發(fā)現(xiàn)48種，分為7個亞家族（A-G）。ABC轉(zhuǎn)運蛋白由兩個跨膜結(jié)構(gòu)域（TMD）和兩個胞質(zhì)側(cè)ATP結(jié)合域（NBD）組成,。TMD通過構(gòu)象變化實現(xiàn)分子跨膜轉(zhuǎn)運,，NBD結(jié)合或水解胞漿中的ATP,，確保轉(zhuǎn)運底物所需能量,。而在ABCA亞家族中特-有的結(jié)構(gòu)是胞外結(jié)構(gòu)域（ECD）和調(diào)控結(jié)構(gòu)域（RD），尚未在其他亞家族中發(fā)現(xiàn),。

南方科技大學龔欣課題組致力于研究ABCA亞家族相關(guān)蛋白的三維結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)運機制,。2017年，龔欣老師作為顏寧教授課題組成員,，在Cell雜志首-次報道了ABCA1近原子分辨率的冷凍電鏡結(jié)構(gòu),。近年來龔欣課題組陸續(xù)解析了ABCA3、ABCA4的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)及轉(zhuǎn)運機制模型,。

ABCA3主要定位于肺泡II型（AT2）細胞內(nèi)的層狀體（LBs）。肺表面活性劑能夠降低肺泡表面張力,，維持正常呼吸,。ABCA3參與表面活性劑的生成，其突變會導(dǎo)致表面活性劑缺陷,，引發(fā)嚴重的肺部疾病,，如新生兒呼吸窘迫綜合征、間質(zhì)性肺炎等,。目前還沒有治療ABCA3突變引起的遺傳性疾病藥物,。

ABCA4基因只編碼視網(wǎng)膜上特定的ABC轉(zhuǎn)運體，ABCA4蛋白幾乎只存在于視網(wǎng)膜的視桿細胞的外節(jié)盤緣上?，F(xiàn)有研究表明ABCA4作為翻轉(zhuǎn)酶,，可以將磷脂酰乙醇胺（PE）和全反式視黃醛（ATR）形成的脂質(zhì)衍生物—視黃基磷脂酰乙醇胺（NRPE），從外節(jié)膜盤的腔內(nèi)側(cè)轉(zhuǎn)運到細胞質(zhì)側(cè),，通過促進NRPE的轉(zhuǎn)移,，進而促進視網(wǎng)膜再生和生成維生素A。

ABCA4存在于視網(wǎng)膜細胞上,，屬于脂質(zhì)內(nèi)向翻轉(zhuǎn)酶,，可將NRPE從外節(jié)膜盤的腔內(nèi)側(cè)轉(zhuǎn)運到細胞質(zhì)側(cè)。ABCA4的脂質(zhì)轉(zhuǎn)運功能受損,，會使得全反式視黃醛ATR和NRPE在外節(jié)膜盤的腔內(nèi)側(cè)發(fā)生過量積累,，引起視網(wǎng)膜退行性疾病，如常見的遺傳性黃斑變性疾病,、年齡相關(guān)的黃斑變性,、色素性視網(wǎng)膜炎和錐桿營養(yǎng)不良等。盡管ABCA4在視覺系統(tǒng)脂質(zhì)轉(zhuǎn)運、視循環(huán)過程中起著至關(guān)重要的作用,，但此前對于ABCA4的分子結(jié)構(gòu),、底物識別和轉(zhuǎn)運機制還缺乏相應(yīng)的研究。

研究內(nèi)容

在本研究中,，研究人員通過體外重組表達和純化獲得ABCA3蛋白,、ABCA4蛋白，測定ABCA3,、ABCA4各自的ATP酶活性和相應(yīng)的酶動力學參數(shù),，純化后的蛋白存在與先前報道一致的蛋白切割和糖基化修飾，均表現(xiàn)出強大的ATP酶活性,。研究人員通過冷凍電鏡技術(shù),，確定ABCA3、ABCA4分別在apo狀態(tài),、結(jié)合ATP時的三維結(jié)構(gòu),。

01：ABCA3、ABCA4的結(jié)構(gòu)

 ABCA3與ABCA4結(jié)構(gòu)基本相似,，兩者最-大區(qū)別是ECD結(jié)構(gòu)域的差異,。研究發(fā)現(xiàn)，ABCA3的ECD只覆蓋堿基的核心區(qū)域,，ABCA4的ECD結(jié)構(gòu)相對較大，可分為蓋層,、隧道層和基底層三層,，并且其中一個ECD中存在一個擴展環(huán)用于底物結(jié)合。

圖1  ABCA亞家族蛋白三維結(jié)構(gòu)

02：ABCA4的底物識別

ABCA4對底物NRPE的識別進一步說明TMD存在底物結(jié)合位點,。ABCA4的底物NRPE被夾兩個TMD之間,，但完-全暴露在脂質(zhì)雙分子層中，表明脂質(zhì)底物從管腔膜小葉側(cè)向進入跨膜區(qū)的底物結(jié)合位點,。當存在PE時ATR可刺激ABCA4的ATP酶活性,，在與NRPE底物的復(fù)合物結(jié)構(gòu)中，觀察到NRPE結(jié)合位點的準確性,。

03：TMD在ABCA3,、ABCA4中的構(gòu)象  

TMD區(qū)域內(nèi)存在“側(cè)向通道”，2個側(cè)向空腔可作為底物結(jié)合位點,。本研究驗證了基質(zhì)從膜內(nèi)小葉進入的“側(cè)向通道”機制,。在無核苷酸狀態(tài)下，ABCA3的TMDs表現(xiàn)出與ABCA4和ABCA1無核苷酸時相似的側(cè)向開放構(gòu)象,，允許脂質(zhì)底物從2個膜小葉中側(cè)向進入TMD,。TMD內(nèi)2個帶正電荷的側(cè)向空腔可以作為潛在的底物結(jié)合位點,，而填充在2個TMD之間空腔中的脂質(zhì)分子維持著TMD在這種側(cè)向開放構(gòu)象中的穩(wěn)定性，同時證明側(cè)向開放構(gòu)象是依賴ATP的結(jié)合,。

04：ABCA轉(zhuǎn)運機制模型  

ABCA3,、ABCA4的構(gòu)象在結(jié)合ATP前后發(fā)生相似的變化，通過“側(cè)向進入和擠壓”機制轉(zhuǎn)運脂質(zhì)分子,。當無ATP和底物存在時,，TMD表現(xiàn)出V型橫向開放構(gòu)象，允許NRPE從腔膜小葉橫向進入,，識別并結(jié)合底物,。當結(jié)合ATP后，NBD二聚化,，TMD的V型側(cè)向開放構(gòu)象伴變成封閉構(gòu)象,，無法與底物結(jié)合，將脂質(zhì)底物擠壓過膜,，實現(xiàn)脂質(zhì)底物的跨膜翻轉(zhuǎn),。

圖3   ABCA蛋白轉(zhuǎn)運機制模型

研究結(jié)論

本研究通過冷凍電鏡解析ABCA3、ABCA4在不同轉(zhuǎn)運狀態(tài)下的高分辨率三維結(jié)構(gòu),，以及ATP驅(qū)動脂質(zhì)底物轉(zhuǎn)運過程中的構(gòu)象變化,，揭示ABCA3、ABCA4對脂質(zhì)底物獨-特的“側(cè)向進入和擠壓”的轉(zhuǎn)運機制,，為ABCA3,、ABCA4的功能研究以及相關(guān)疾病的藥物研發(fā)提供重要的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ),，也為闡明ABCA轉(zhuǎn)運蛋白底物識別和轉(zhuǎn)運機制提供新方向,。

義翹神州蛋白結(jié)構(gòu)研究產(chǎn)品

義翹神州成功開發(fā)系列無血清細胞培養(yǎng)基產(chǎn)品，可用于HEK293,、CHO,、昆蟲細胞以及雜交瘤細胞的培養(yǎng)和蛋白表達。所有細胞培養(yǎng)基均為即用型,，經(jīng)過數(shù)千種蛋白及抗體表達案例的驗證,，具有蛋白表達量高、細胞生長好,、質(zhì)控嚴格,、批次穩(wěn)定性好等特點，已經(jīng)被多個知-名實驗室用于細胞培養(yǎng)和蛋白表達研究,。義翹神州已通過ISO 13485和ISO 9001雙認證,，培養(yǎng)基生產(chǎn)的整個過程嚴格按照GMP規(guī)范進行管理，部分產(chǎn)品已完成美國FDA DMF備案,，全面支持細胞治療,、基因治療、抗體藥生產(chǎn)和診斷原料生產(chǎn)等領(lǐng)域的應(yīng)用。

SMM 293-CD1無血清細胞培養(yǎng)基, Cat: M293CD1

廣泛適用各種HEK293細胞  

高效和高密度轉(zhuǎn)染  

即用型完-全培養(yǎng)基,，不用添加其他組分  

無動物源組分,，無血清，化學成分明確