實驗過程:

一,、總RNA的提取
總RNA提取可以：（1）獲得高純度、高質量的總RNA,；（2）可以滿足生物學下游實驗Northern Blot,、核酸酶保護實驗、RT-PCR,、qRT-PCR 和陣列分析所需。

二,、cDNA第一鏈的合成
目前試劑公司有多種cDNA第一鏈試劑盒出售,，其原理基本相同，但操作步驟不一?，F(xiàn)以GIBICOL公司提供的SuperScriptTM Preamplification System for First Strand cDNA Synthesis 試劑盒為例,。

1． 在0.5 ml微量離心管中，加入總RNA 1-5 μg,，補充適量的DEPC H2O使總體積達11 μl,。在管中加10 μM Oligo（dT）12-18 1 μl，輕輕混勻,、離心,；

2．70℃加熱10min，立即將微量離心管插入冰浴中至少1min,；

3． 取0.5 ml PCR管,，依次加入下列試劑：第一鏈cDNA 2 μl；上游引物（10 pM） 2 μl,；下游引物（10 pM） 2 μl,；dNTP(2mM) 4 μl；10×PCR buffer 5 μl,；Taq 酶（2 u/μl） 1 μl,。輕輕混勻,，離心。42℃孵育2-5 min,；
4．加入SuperscriptⅡ1 μl ,，在42℃水浴中孵育50 min；

5． 于70℃加熱15 min以終止反應,；

6．將管插入冰中,，加入RNase H 1 μl ，37℃孵育20 min,，降解殘留的RNA,。-20℃保存?zhèn)溆谩?br/>

三、PCR
1．取0.5 ml PCR管,，依次加入下列試劑：第一鏈cDNA   2 μl,；上游引物（10 pM）2 μl；下游引物（10 pM）2 μl,；dNTP(2 mM) 4 μl,；10×PCR buffer 5 μl；Taq 酶（2 u/μl）1 μl,；

2．加入適量的ddH2O,，使總體積達50 μl。輕輕混勻,，離心,；

3．設定PCR程序。在適當?shù)臏囟葏?shù)下擴增28-32個循環(huán),。為了保證實驗結果的可靠與準確,，可在PCR擴增目的基因時，加入一對內參（如G3PD）的特異性引物,，同時擴增內參DNA,，作為對照；

4．電泳鑒定：行瓊脂糖凝膠電泳,，紫外燈下觀察結果,；

5．密度掃描、結果分析：采用凝膠圖像分析系統(tǒng),，對電泳條帶進行密度掃描,。

注意事項:

1．在實驗過程中要防止RNA的降解，保持RNA的完整性,。在總RNA的提取過程中,，注意避免mRNA的斷裂；

2． 為了防止非特異性擴增,，必須設陰性對照,；

3．內參的設定：主要為了用于靶RNA的定量,。常用的內參有G3PD（甘油醛-3-磷酸脫氫酶）、β-Actin（β-肌動蛋白）等,。其目的在于避免RNA定量誤差,、加樣誤差以及各PCR反應體系中擴增效率不均一各孔間的溫度差等所造成的誤差；

4． PCR不能進入平臺期,，出現(xiàn)平臺效應與所擴增的目的基因的長度,、序列、二級結構以及目標DNA起始的數(shù)量有關,。故對于每一個目標序列出現(xiàn)平臺效應的循環(huán)數(shù),，均應通過單獨實驗來確定；

5． 防止DNA的污染： 采用DNA酶處理RNA,； 在可能的情況下,，將PCR引物置于基因的不同外顯子，以消除基因和mRNA的共線性,。