文獻(xiàn)導(dǎo)讀| 影響納米顆粒跟蹤分析技術(shù)的關(guān)鍵參數(shù)——標(biāo)準(zhǔn)操作流程的建立

近日,中國科學(xué)院上海藥物研究所于International Journal of Pharmaceutics上發(fā)表題為“納米材料大小和濃度的關(guān)鍵參數(shù)以標(biāo)準(zhǔn)化納米顆粒跟蹤分析”的文章,。該項(xiàng)研究中,,作者系統(tǒng)性地評(píng)估了包括樣品構(gòu)成,樣品濃度,,儀器設(shè)置參數(shù),,相機(jī)設(shè)置參數(shù),液體流速對(duì)于NTA (NanoSight NS300) 測(cè)量準(zhǔn)確性的影響,。在研究過程中,,他們同時(shí)選取了顆粒粒徑表征的金標(biāo)準(zhǔn)——透射電子顯微鏡及基于電阻脈沖感應(yīng) (RPS) 原理的NanoCoulter納米庫爾特粒度分析儀進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn),交叉驗(yàn)證NTA對(duì)顆粒粒徑及濃度測(cè)量的精度,。


圖1樣品濃度對(duì)NTA測(cè)量結(jié)果的影響。
作者使用了不同大小的聚苯乙烯 (PS) 和二氧化硅 (SiO2)標(biāo)準(zhǔn)顆粒,,在不同的粒子濃度下進(jìn)行了測(cè)量,,并比較了不同濃度下的平均尺寸和濃度偏差。結(jié)果顯示,,當(dāng)粒子濃度在108-109 particles/mL之間時(shí),,測(cè)量結(jié)果最為準(zhǔn)確,線性趨勢(shì)最好,。此時(shí)對(duì)應(yīng)視野內(nèi)的顆粒數(shù)為10-100和400-6500個(gè),。


圖2. 曝光度對(duì)NTA測(cè)量結(jié)果的影響
與DLS不同,NTA通過相機(jī)追蹤顆粒的實(shí)時(shí)的布朗運(yùn)動(dòng)進(jìn)行顆粒粒徑計(jì)算,。因此優(yōu)化相機(jī)設(shè)置參數(shù)可以顯著提高NTA測(cè)得的粒徑和濃度的準(zhǔn)確性,。作者使用了混合的不同尺寸的PS顆粒,在不同的曝光度 (camera level) 下進(jìn)行了表征,。曝光度是表明相機(jī)對(duì)顆粒運(yùn)動(dòng)敏感程度的參數(shù),。通過調(diào)節(jié)曝光度,可以影響NTA的拍照結(jié)果,。結(jié)果顯示,,在曝光度為6-9時(shí),100 nm的PS顆粒觀測(cè)不佳,,而200 nm的PS顆粒清晰可見,,當(dāng)曝光度為10-14時(shí),100 nm的PS顆粒可以清晰地被觀測(cè)到,,而200 nm的PS顆粒會(huì)過曝,,影響結(jié)果。隨后作者進(jìn)一步評(píng)估了曝光度對(duì)100 nm,,120 nm,,150 nm,170 nm和200 nm的PS顆粒的粒徑峰值及分布進(jìn)行了表征,。結(jié)果表明,,曝光度變化并未顯著影響PS顆粒的粒徑峰值,但是隨著曝光度上升,,各組PS顆粒的粒徑平均值上升,。因此作者認(rèn)為具體的不同大小的顆粒會(huì)與曝光度共同影響粒徑的測(cè)量結(jié)果。當(dāng)樣本分散度較大時(shí),,NTA相機(jī)難以找到合適的曝光度以保證可以拍到所有顆粒,。在撰寫相關(guān)報(bào)告的時(shí)候,需要將NTA的曝光度等設(shè)定參數(shù)一并提交,,以保證數(shù)據(jù)透明性,。


之前的研究已經(jīng)表明,溶液粘度會(huì)影響NTA測(cè)量結(jié)果的準(zhǔn)確性,,但是對(duì)于泵速對(duì)測(cè)量結(jié)果有何影響仍是未知,,因此作者使用了不同大小的PS顆粒,在不同的泵速下進(jìn)行了測(cè)量,,并比較了不同速度下的平均尺寸和濃度偏差,。結(jié)果顯示,對(duì)于小于200 nm的顆粒,,泵速在50 AU (arbitrary unit)以內(nèi)可以得到較為準(zhǔn)確的結(jié)果,,而對(duì)于更大的顆粒,則需要更低的泵速才能保證準(zhǔn)確性,。

圖4. NTA,、DLS和RPS對(duì)多分散樣本的測(cè)量影響
隨后基于這些結(jié)果,作者按照該標(biāo)準(zhǔn)操作流程,,評(píng)估了NTA對(duì)于多分散樣品的表征能力,。作者制備了1: 1和10: 1(濃度比)的100 nm和150 nm PS顆粒混合物,,根據(jù)不同的曝光度,,NTA在7-10的范圍內(nèi)對(duì)兩個(gè)樣品都可以順利測(cè)量得出兩個(gè)粒徑峰位。隨后,,作者進(jìn)一步制備了1: 1: 1的100 nm,,150 nm和200 nm及1: 1: 1: 1的100 nm,150 nm,170 nm和200 nm的三混合和四混合樣本,,結(jié)果表明NTA無法完成測(cè)量,僅能得出一個(gè)寬峰,。隨后作者進(jìn)一步使用DLS和RPS對(duì)上述四個(gè)樣本進(jìn)行分析,,DLS對(duì)于上述四個(gè)樣本都無法測(cè)量得到精確峰位,僅能得到一個(gè)單峰,,而基于RPS理論的NanoCoulter通過單顆粒檢測(cè)手段,,成功地測(cè)量出混合物的粒徑,并得出精確峰位,。隨后作者進(jìn)一步驗(yàn)證了RPS的粒徑測(cè)量效果,,制備了濃度比為1: 1: 1: 1的80 nm,120 nm,,160 nm和200 nm的混合物,。測(cè)量結(jié)果再次證實(shí)RPS可以順利地將混合物測(cè)出對(duì)應(yīng)的峰,并且不同的樣品峰之間區(qū)分明顯,,分辨率良好,。這種四分布樣品可以更真實(shí)的代表實(shí)際樣品。
最后,作者選取了兩種外泌體(分別來源于HEK293細(xì)胞和干姜),,分別使用NTA,,DLS和RPS技術(shù)進(jìn)行粒徑分析。結(jié)果表明在粒徑分析方面,,NTA所得到的數(shù)據(jù)與TEM相似,,而DLS粒徑值偏大,RPS所得粒徑結(jié)果偏小,。在濃度方面,,RPS表現(xiàn)出更精確的定量分析能力,這得益于RPS的單顆粒檢測(cè)技術(shù),,可以對(duì)每一個(gè)顆粒實(shí)現(xiàn)精確表征,。
通過對(duì)實(shí)際樣品的測(cè)量,作者歸納總結(jié)了四種不同的顆粒表征方法的特點(diǎn)(表1),。作者認(rèn)為NTA在顆粒粒徑分析方面具有良好的分辨率和高準(zhǔn)確性,,可以區(qū)分2-3種模態(tài)的樣本,但是對(duì)于外泌體類的樣本,,NTA無法分辨外泌體,,囊泡和脂蛋白,同時(shí)NTA也無法對(duì)不同來源的外泌體進(jìn)行區(qū)分。對(duì)于DLS,,作者認(rèn)為該方法十分簡(jiǎn)便,,微量樣本即可完成測(cè)量,但是該方法測(cè)得的粒徑值與真實(shí)情況相比偏差較大,,并且該方法無法測(cè)量樣品顆粒濃度,。TEM方法則可以直接實(shí)現(xiàn)樣本顆粒的可視化測(cè)量,但是該方法成本高昂,,費(fèi)時(shí)費(fèi)力,。對(duì)于RPS,作者認(rèn)為該方法可以直接測(cè)量顆粒真實(shí)粒徑(尤其是未知樣本的顆粒特征情況下),,并對(duì)多模態(tài)的混合樣本有良好的分辨率,。
表1. 四種不同粒徑分析方法的特點(diǎn)匯總
通過該工作,作者系統(tǒng)的評(píng)估了包括濃度,,儀器閾值,,曝光度,泵流速等因素對(duì)NTA性能的影響,,他們發(fā)現(xiàn)在濃度為108~109,,泵流速為50AU時(shí),對(duì)于顆粒樣本可以得到較為精確的表征結(jié)果,,同時(shí),,他們也提出對(duì)于儀器閾值及曝光度這兩個(gè)參數(shù),則需要結(jié)合樣本的粒徑具體問題具體分析,。同時(shí),,他們也發(fā)現(xiàn)NTA對(duì)于多分散樣品分析能力不佳,而RPS則可以成功的區(qū)分三峰或四峰樣品,,表明RPS對(duì)于多分散樣本具有更優(yōu)異的區(qū)分能力,。同時(shí)作者選用多種表征手段對(duì)兩種外泌體進(jìn)行了分析,各個(gè)表征手段所得到的粒徑與濃度并不相同,,因此作者認(rèn)為在進(jìn)行生物學(xué)顆粒研究時(shí),,需要運(yùn)用正交方法學(xué)對(duì)顆粒進(jìn)行多重表征。
參考文獻(xiàn)
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