估計 EV的 數(shù)量,、確定 EV 的存在以及評估EV 制備中非 EV 組分的份額和影響等都需要對EV進(jìn)行表征。EV的表征面臨著小粒徑,、尺寸異質(zhì)性和分子異質(zhì)性,、缺乏通用 EV 識別方法以及許多測量技術(shù)的非 EV 特異性的挑戰(zhàn)。沒有任何一種測量或方法能夠滿足所有 EV 表征的要求,，因此建議使用正交方法（即沒有相同測量限制的方法）彼此驗(yàn)證,，也就是說EV的表征參數(shù)作為關(guān)鍵質(zhì)量屬性 (CQA) 推薦采用兩種或兩種以上不同原理的方法檢測同一指標(biāo)。
EV 的總體組成（蛋白質(zhì),、脂質(zhì),、核酸和其他生物分子等的含量及比例）因 EV 來源而異。雖然這些單個分子類別的測量可用于估計 EV 豐度,，但這些值不一定與 EV 濃度全部相關(guān),，而且源材料之間也不存在普遍性；因此,，它們不應(yīng)用作 EV 濃度的衡量標(biāo)準(zhǔn),。正如沒有單一分子的檢測可以量化所有 EV 一樣，也沒有 EV 或 EV 亞型的通用分子標(biāo)記,。必須根據(jù)來源特異性和類型特異性的證據(jù)來選擇特定的標(biāo)記,。目前，尚無已知的通用標(biāo)記可以識別所有EV,，無論其來源如何,。對于所謂的外泌體，這些標(biāo)記的普遍性尚不清楚或不被接受,。請注意,，涉及四次跨膜蛋白 CD9、CD63 和 CD81 的基于親和力的方案對于作為 EV 亞型的外泌體并不具有特異性,；使用針對這些四次跨膜蛋白中的某一個的抗體富集的EV群體并不能不全面覆蓋所有的分子組成,。此外，并非所有 EVs都表達(dá)這些蛋白標(biāo)志物,，因此四次跨膜蛋白富集并不能捕獲所有 EVs,。檢測同一表征參數(shù)的正交方法（不止一種原理的方法）不太可能具有相同的偏差；例如,，同時通過光學(xué)方法與非光學(xué)方法分別推導(dǎo)和檢測EV的直徑,。使用正交方法對 EV 樣本進(jìn)行表征，對于證明共分離物與生物標(biāo)志物或功能發(fā)現(xiàn)無關(guān)也至關(guān)重要,。由于許多EV表征方法不是特定適用于EV的,，或者無法檢測所有的EV,，因此需要將方法和結(jié)果透明公布以確保EV數(shù)據(jù)的可重復(fù)性。
EV 的數(shù)量和體積測量一同定義了數(shù)濃度（以particles/mL 為單位）,，這是一種被廣泛報道并使用的指標(biāo)。然而,，它通常不可靠,，因?yàn)樵S多技術(shù)缺乏對EV的特異性和對所有EV的敏感性。ISEV 嚴(yán)格和標(biāo)準(zhǔn)化EV參考材料工作組最近概述了測量技術(shù)的考慮因素,，以及該領(lǐng)域在面對可追溯測量,、開發(fā)和報告良好表征的EV參考材料方面所面臨的挑戰(zhàn)。這項(xiàng)工作的一個關(guān)鍵亮點(diǎn)是需要公布檢測方法的 LOD,，從而允許其他人驗(yàn)證結(jié)果,，而不管靈敏度限制如何。通過使用正交方法可以提高 EV 濃度測量的可信度,，每種方法都具有確定的 LOD,，例如檢測光散射強(qiáng)度（如NTA）、熒光強(qiáng)度（如FCM）和物理大小（如RPS）,，因?yàn)檎环椒]有相同的測量限制,。例如，電阻脈沖感應(yīng) (RPS) 技術(shù),，就可以用粒徑來表示 LOD,。對于流式細(xì)胞術(shù)等光學(xué)技術(shù)，LOD 可以用源自光散射光學(xué)模型的直徑或源自熒光強(qiáng)度的等效可溶性熒光團(tuán) (MESF) 分子來報告,。這些方法可以在不同儀器和靈敏度之間產(chǎn)生一致的數(shù)據(jù),。由于顆粒檢測涉及的變量較多，因此目前尚無方法為納米顆粒跟蹤分析 (NTA),、動態(tài)光散射 (DLS) 或成像流式細(xì)胞術(shù)得出可追溯的 LOD,。對于無法區(qū)分 EV 與其他潛在共分離物或污染物的技術(shù)，無論上游分離步驟如何,，都建議將濃度報告表示為“顆粒濃度或 EP 濃度”而不是“EV 濃度”,。EV 大小（以納米半徑或直徑為單位）的測量依賴于球形度或遷移率等假設(shè),，并且輸出結(jié)果可能受到上游變量的影響,。常見的高通量方法，包括流式細(xì)胞術(shù),、NTA,、RPS、多角度光散射和動態(tài)光散射 (DLS) 都假設(shè) EV 是球形的,。雖然“大小”和“直徑”經(jīng)常在測量方法之間互通使用,，但它們的推導(dǎo)方式也可能導(dǎo)致測量技術(shù)間的一致差異。例如,，依賴于顆粒布朗運(yùn)動的技術(shù)（如 NTA 或 DLS）測量的是流體動力學(xué)直徑,，與冷凍電鏡等成像方法相比，會導(dǎo)致顆粒大小估計過高,。而很少有方法能夠在整個EV可能的直徑范圍內(nèi)（從幾十納米到微米）精確測量 EV 尺寸,。例如，雖然冷凍電鏡的高分辨率成像是最準(zhǔn)確的方法之一,，但它的檢測通量相對較低,，而且許多較大的 EV 往往數(shù)量較少而可能無法量化。定量低于 100 nm 的低對比度 EV 的能力也可能是一個限制因素,。
隨著越來越多的研究人員使用靈敏度更高的專用單顆粒分析技術(shù),，越來越清楚的是，許多 EV 制劑表現(xiàn)出不對稱的右偏分布,，例如對數(shù)正態(tài)分布,，其中大多數(shù) EV 直徑 <100 nm。大多數(shù)單顆粒分析技術(shù)無法解析全部的 EV 群體,，因此研究者應(yīng)共享檢測到的 EV 直徑分布,，而不僅僅是平均大小、集中大小或中位值大小等匯總指標(biāo),，這些指標(biāo)很容易由于 LOD 和不對稱大小分布而傾斜,。請注意，擬合大小統(tǒng)計數(shù)據(jù),，例如通過 NTA 對低折射率顆粒進(jìn)行測量,，可能更接近儀器的 LOD而不是 EV 群體的真實(shí)模態(tài)直徑。使用具有專有算法的軟件來確定粒徑的技術(shù)也可能導(dǎo)致軟件版本或軟件平臺之間的差異,，因此也應(yīng)該提供軟件及其版本,。從折射率假設(shè)推導(dǎo)出大小的技術(shù)可能會由于不同的樣本成分和裝載物而導(dǎo)致變化,。從熒光探針（例如膜嵌入染料）推導(dǎo)的大小則可能會由于基于不同膜脂成分的不同染料嵌入而導(dǎo)致變化。對于無法區(qū)分 EV 和共分離物/污染物的技術(shù),，無論上游分離步驟如何,，建議將直徑報告表述為“顆粒”或“EP”直徑,，而不是“EV 直徑”,。
三,、EV表征技術(shù)特定報告的注意事項(xiàng)
隨著 EV 檢測實(shí)驗(yàn)和儀器的使用和專家知識的拓展，相關(guān)表征報告尺度的確定也在不斷增加,，以確保數(shù)據(jù)的可靠性和可重復(fù)性,。MISEV2023指南詳細(xì)列出了最小實(shí)驗(yàn)和儀器特定報告的注意事項(xiàng)列表。無論實(shí)驗(yàn)設(shè)計如何,，這些通常都適用,。這里列出的技術(shù)并不詳盡，許多檢測技術(shù)正在開發(fā)或正在積極研究,。然而,，所列出的技術(shù)都是商業(yè)上可獲得的，并且有來自多個研究人員的發(fā)表文獻(xiàn),。（由于篇幅限制,，筆者在此只列出當(dāng)前常用的幾種EV粒徑和濃度表征工具的描述及其主要觀點(diǎn)）ISEV建議，對照組應(yīng)包括作為檢測抗體的同型抗體,，或同型偶聯(lián)的捕獲微珠,，以及僅含有檢測抗體的捕獲微珠（用于抗體包被的捕獲珠）；應(yīng)使用多個 EV上樣濃度來展示信號的滴定,；如果制備微珠,，應(yīng)公布其試劑和化學(xué)成分；商業(yè)捕獲微珠試劑的目錄和批號也應(yīng)公布,；公布標(biāo)準(zhǔn)化微珠的中位熒光強(qiáng)度值,；公布來自單態(tài)圈定微珠的等效可溶性熒光團(tuán) (MESF) 分子的數(shù)據(jù)和中位熒光強(qiáng)度值統(tǒng)計（與單 EV 流式細(xì)胞術(shù)一樣）；應(yīng)公布完整且詳細(xì)的方法學(xué),。2023年,，經(jīng)由國際細(xì)胞外囊泡學(xué)會（ISEV）,、國際細(xì)胞計數(shù)進(jìn)步學(xué)會,、國際血栓與止血學(xué)會組成的三學(xué)會工作組（EV流式細(xì)胞術(shù)工作組）倡議,，出版了《單EV流式細(xì)胞術(shù)綱要》，全面解決開發(fā)單 EV 流式細(xì)胞術(shù)檢測的注意事項(xiàng),。樣本體積,、熒光和光散射參數(shù)的校準(zhǔn)對于單 EV 流式結(jié)果的解釋和復(fù)制至關(guān)重要。如果使用單 EV 流式細(xì)胞儀報告顆粒濃度,，請確定LOD的上限和下限,，以允許使用正交方法或其他人來重復(fù)和驗(yàn)證該結(jié)果。目前,，成像細(xì)胞儀使用動態(tài)觸發(fā)方法,，這使得較低 LOD 的確定難以定義，因此難以標(biāo)準(zhǔn)化,。DLS,，也稱為光子相關(guān)光譜 (PCS) 和準(zhǔn)彈性光散射 (QELS)，是一種能夠確定稀釋水溶液分散體中充分單分散顆粒的流體動力學(xué)直徑的技術(shù),。DLS 測量溶液中多個顆粒散射的激光強(qiáng)度的自相關(guān)函數(shù),。自相關(guān)函數(shù)攜帶有關(guān)顆粒擴(kuò)散系數(shù)的信息，該信息通過斯托克斯-愛因斯坦布朗運(yùn)動理論與流體動力學(xué)直徑相關(guān),。可以使用多種算法從測量的自相關(guān)函數(shù)導(dǎo)出擴(kuò)散系數(shù),。最常見的方法是累積量分析，但是它假設(shè)樣本都是單分散的大小分布,，而 EV 樣本是不具備這種分布的,。對于 EV 樣本的多分散大小分布，擴(kuò)散的推導(dǎo)自相關(guān)函數(shù)的系數(shù)分布成為一個不適定的數(shù)學(xué)問題,。這意味著 DLS 不應(yīng)用于確定 EV 樣品的定量屬性,，除非 DLS 應(yīng)用于 EV 的具有單分散尺寸的某一部分。另一方面,，DLS 可用于定性確認(rèn) EV 樣品中可能存在的亞微米顆粒和可能的聚集體的存在,。各種電子顯微鏡 (EM) 是少數(shù)能夠檢測EV（無論大小如何）的技術(shù)之一。然而,，電鏡的通量也意味著與較小的EVs相比,，較大的EVs在統(tǒng)計上會被低估。SEM,、TEM和Cryo-EM都是高分辨率的EV表征方法,，它們也不必互相切換或能夠提供具有質(zhì)量可比的圖像。例如,，Cryo-EM可以清楚地顯示脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu),，比TEM用于固定樣品的脫水條件更好地保持了 EV 形態(tài),，并且可能更加準(zhǔn)確定量（大小）,，因?yàn)橐欢w積中的所有顆粒都可以成像,，而不僅僅是那些粘附在載網(wǎng)表面上的顆粒。為確定低報告要求而對 EM 方法進(jìn)行的標(biāo)準(zhǔn)化研究非常有限,。對于 TEM,，應(yīng)公布三個主要參數(shù)：固定、吸附和負(fù)染色方法,。固定包括：使用的固定劑及其濃度和孵育時間,；吸附包括載網(wǎng)材料、載網(wǎng)尺寸,、薄膜類型,、涂層、孵育時間和清洗細(xì)節(jié),；負(fù)染色的詳細(xì)信息應(yīng)包括底物,、濃度和孵育時間。并且,，應(yīng)公布低倍率和高倍率圖像以及圖像的選擇標(biāo)準(zhǔn),。NTA，也認(rèn)為是一種單顆粒跟蹤,，是 EV 領(lǐng)域廣泛使用的一種光學(xué)技術(shù),，用于估計顆粒尺寸和濃度。NTA 通常采用減少直徑分布變化的算法,，通過測量顆粒的擴(kuò)散系數(shù)得出流體動力學(xué)直徑,。值得注意的是，某些NTA設(shè)備上使用的 FTLA 算法是為了更好地表示單分散混合物而開發(fā)的,，而 EV 則不然,，這可能會導(dǎo)致人為的多種擬合分布。并且,，目前沒有方法可以確定或公布 NTA 設(shè)置 的LOD,。很多學(xué)者已經(jīng)進(jìn)行了幾項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)化研究來比較用戶和儀器之間的結(jié)果。使用 NTA 測量復(fù)雜生物流體樣本的直徑分布和濃度應(yīng)謹(jǐn)慎解釋,，因?yàn)樗鼤χ鞍缀痛蟮鞍讖?fù)合物等共分離物進(jìn)行計數(shù),，并且NTA難以量化直徑在幾百納米以上的 EV。對于 NTA 的公布信息,，應(yīng)包括儀器型號,、相機(jī)類型、相機(jī)設(shè)置、激光波長,、激光功率,、軟件版本、分析設(shè)置和每幀粒子,。如果已知,，則應(yīng)公布用于生成直徑分布的算法，因?yàn)楦鶕?jù)所使用的算法可能會產(chǎn)生不同的結(jié)果,。在光散射或熒光檢測模式的情況下,，建議使用空白緩沖液作為對照。對于熒光 NTA,，報告光散射模式下的總顆粒數(shù)以及熒光模式下的標(biāo)記顆粒數(shù)，以及標(biāo)記去除方法和緩沖液/試劑控制從而評估標(biāo)記的偽彩情況,。如果使用了流體上樣裝置也應(yīng)將其設(shè)置公布,。這是MISEV第一次將電阻脈沖感應(yīng) (RPS) 技術(shù)作為與基于流式的方法（包括基于微珠的流式和單EV流式）和基于顯微鏡的方法（包括原子力顯微鏡、電鏡,、DLS,、NTA、超分辨顯微鏡等）并列推薦的常用EV顆粒表征方法,。也是為數(shù)不多的非光學(xué)原理的EV表征技術(shù)之一,。RPS利用庫爾特原理來確定顆粒的濃度和直徑，以及某些設(shè)備還具備zeta 電位功能,。目前 RPS 的直徑LOD低至 ～50 nm,。文獻(xiàn)報道，RPS 測量結(jié)果確實(shí)與 TEM 數(shù)據(jù)具有非常高的一致性,。報告 RPS 數(shù)據(jù)時,，建議公布儀器型號、孔徑,、校準(zhǔn)微珠直徑和來源以及軟件版本,。如之前所述（顆粒大小的定量），對于 EV 數(shù)據(jù),，推薦公布RPS的直徑分布而不是單一直徑統(tǒng)計數(shù)據(jù),。并且建議納入空白緩沖液的對照來識別背景，以及相同濃度的去污劑裂解后的樣品以確定標(biāo)記事件,。由于 RPS 技術(shù)很容易被較大顆粒堵塞,，因此可以使用離心或過濾等分析前步驟來去除較大顆粒。由于這些方法可能會改變正在分析的 EV 群體并影響與正交方法的比較,，因此應(yīng)明確說明任何分析前處理程序,。需提供蛋白質(zhì)富集和定量的詳細(xì)信息；如果可能，需包括抗原的陽性和陰性對照 ,；如果聲稱蛋白質(zhì)與 EV 相關(guān),，需要包括 EV 制劑的純度測量。報告標(biāo)準(zhǔn)化上樣,、凝膠電泳,、轉(zhuǎn)膜方法、探針和成像/分析的所有詳細(xì)信息（包括但不限于抗體信息,、樣品變性和還原條件,、轉(zhuǎn)膜方法、膜類型,、緩沖液以及成像設(shè)備和參數(shù)）,；提供所有WB的未裁剪圖像（如果在期刊上發(fā)表，則需要作為補(bǔ)充信息）,。該指南在以上各章節(jié)中,，分別討論了 EV 表征的不同方法，并提供了具體建議,。無論采用何種方法,，表征的總體建議總結(jié)如下：- 每種 EV 制劑應(yīng)通過 EV 來源的定量測量來定義（例如，分泌細(xì)胞的數(shù)量,、生物流體的體積,、組織的質(zhì)量等）。
- 應(yīng)估算 EV 的豐度（包括顆粒數(shù)量,、蛋白質(zhì)和/或脂質(zhì)含量）,。
- 應(yīng)檢測 EV 制劑是否存在與 EV 亞型或EV 相關(guān)的成分，具體取決于實(shí)驗(yàn)?zāi)康乃璧奶禺愋浴?/span>
- 當(dāng)使用定量指標(biāo)表征 EV 時，需提供儀器或方法的檢測限 (LOD) ,。
手機(jī)版
化工儀器網(wǎng)手機(jī)版
化工儀器網(wǎng)小程序
官方微信
公眾號：chem17
掃碼關(guān)注視頻號
采購中心