高密度微載體生物反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)

來(lái)源：廣州市艾貝泰生物科技有限公司 2024年09月24日 11:55

　河南省預(yù)防型疫苗工程技術(shù)研究中心,，河南省生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)研究院與河南省生物醫(yī)藥工程技術(shù)研究中心等多個(gè)團(tuán)隊(duì)通力合作,，在生物制品學(xué)雜志發(fā)表關(guān)于生物反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)狂犬病病毒的成果，該研究為150 L生物反應(yīng)器高密度微載體工藝放大提供了技術(shù)支持,，為后期開(kāi)發(fā)更大規(guī)模高密度微載體反應(yīng)器工藝奠定基礎(chǔ),。

　　狂犬病病毒(rabies virus, RABV)是致死率高的病毒，分布于多種哺乳動(dòng)物宿主,，這些宿主與人類(lèi)之間存在復(fù)雜的關(guān)系,。目前,，RABV引起的狂犬病每年造成約5.9萬(wàn)人死亡。迄今為止,，狂犬病發(fā)病后幾乎無(wú)治愈病例,，主要通過(guò)提前接種疫苗來(lái)進(jìn)行預(yù)防,。我國(guó)每年人用狂犬病疫苗的消耗量約1600萬(wàn)人份,。對(duì)于狂犬病疫苗的制備，RABV大規(guī)模擴(kuò)增是關(guān)鍵技術(shù),，也是決定成本的重要因素之一,。目前主要采用生物反應(yīng)器(借助微載體)培養(yǎng)Vero細(xì)胞，擴(kuò)增RABV,，再純化病毒等步驟制備狂犬病疫苗,，具有成本較低、技術(shù)較易控制等優(yōu)點(diǎn),，本研究在30 L生物反應(yīng)器的基礎(chǔ)上,，嘗試采用150 L生物反應(yīng)器、高密度微載體培養(yǎng)Vero細(xì)胞,，擴(kuò)增RABV,，以期為規(guī)模化培養(yǎng)RABV,，制備狂犬病疫苗提供參考,。

　　應(yīng)用30 L和150 L生物反應(yīng)器，以灌流方式培養(yǎng)Vero細(xì)胞和CTN-1V株RABV, Cytodex-1微載體濃度20 g/L,，培養(yǎng)溫度36～38℃,，DO 20%～60%，pH 7.0～7.4,，連續(xù)13 d收獲病毒液,，培養(yǎng)過(guò)程中取樣檢測(cè)細(xì)胞密度、病毒滴度,，并對(duì)病毒收獲液進(jìn)行無(wú)菌和支原體檢查及抗原,、宿主細(xì)胞蛋白(host cell protein, HCP)、牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA),、DNA殘留量檢測(cè),。結(jié)果30 L和150 L生物反應(yīng)器的細(xì)胞培養(yǎng)密度均可達(dá)1.2×10⁷個(gè)/mL以上，在培養(yǎng)過(guò)程中各時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞密度差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.225～2.173, P=0.096～0.833),。2種規(guī)模生物反應(yīng)器病毒收獲液均在感染后6 d達(dá)最高病毒滴度(8.5 lgLD50/mL),，且差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.000, P=0.374)。2種規(guī)模生物反應(yīng)器病毒收獲液的抗原,、HCP,、BSA和DNA殘留量基本一致,。可用150 L生物反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)RABV,，病毒收獲液符合《中國(guó)藥典》三部(2020版)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn),。

搖瓶工藝

　　搖瓶中細(xì)胞培養(yǎng)至第4天時(shí)，呈致密單層,，接種RABV毒種,。

生物反應(yīng)器工藝

　　細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中2種規(guī)模生物反應(yīng)器的細(xì)胞密度變化趨勢(shì)相似。細(xì)胞培養(yǎng)至第4天,，密度達(dá)12.0×10⁶個(gè)/m L以上,，30 L生物反應(yīng)器的細(xì)胞密度(12.3×10⁶個(gè)/m L)高于150 L生物反應(yīng)器(12.1×10⁶個(gè)/m L)，但二者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.138, P=0.319),。接毒后細(xì)胞持續(xù)生長(zhǎng)一段時(shí)間,，2種規(guī)模生物反應(yīng)器細(xì)胞密度均在第6天達(dá)最高，分別為13.3×10⁶和13.0×10⁶個(gè)/m L,。隨著病毒培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),，細(xì)胞密度呈下降趨勢(shì)。2種規(guī)模生物反應(yīng)器在培養(yǎng)過(guò)程中各時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞密度差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.225～2.173, P=0.096～0.833),。細(xì)胞密度變化曲線(xiàn)見(jiàn)圖1,；接種細(xì)胞后，細(xì)胞貼附在微載體表面,，形態(tài)飽滿(mǎn),，無(wú)游離細(xì)胞，第4天呈致密單層,，見(jiàn)圖2,；接種病毒后，細(xì)胞逐漸發(fā)生病變,，從微載體上脫落,，死亡，第13天大部分細(xì)胞已脫落,，見(jiàn)圖3,。

圖1

圖2

圖3

病毒收獲液檢定病毒滴度變化

　　30和150 L生物反應(yīng)器中細(xì)胞感染2 d后收獲的第1組病毒液滴度平均值分別為(7.60±0.14)和(7.63±0.09)lg LD50/m L；感染4 d后,，2種規(guī)模生物反應(yīng)器的細(xì)胞密度均下降,、收獲液病毒滴度均增加，均在感染后6 d達(dá)最高病毒滴度,，且差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.000, P=0.374),。隨后病毒滴度緩慢下降，培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，2種規(guī)模生物反應(yīng)器的收獲液病毒滴度均為(7.53±0.12)lg LD50/m L,。見(jiàn)表1和圖4,。表明從30 L放大至150 L的工藝可獲得高滴度的病毒收獲液。

表1

圖4

結(jié)果

　　搖瓶培養(yǎng)目前主要作為細(xì)胞培養(yǎng)擴(kuò)增步驟,，直接應(yīng)用于規(guī)?；a(chǎn)越來(lái)越少。單個(gè)搖瓶產(chǎn)能較小,，規(guī)?；a(chǎn)需至少數(shù)十個(gè)搖瓶同步進(jìn)行，導(dǎo)致人工操作復(fù)雜且強(qiáng)度大,，存在一定的暴露操作風(fēng)險(xiǎn),。搖瓶培養(yǎng)技術(shù)不再是規(guī)模化生產(chǎn)的發(fā)展方向,。

　　應(yīng)用生物反應(yīng)器培養(yǎng)Vero細(xì)胞是疫苗制備的關(guān)鍵技術(shù)，是重要的發(fā)展方向之一,。且生物反應(yīng)器易操控,，適合規(guī)模化放大,，應(yīng)用反應(yīng)器微載體懸浮培養(yǎng)Vero細(xì)胞具有明顯優(yōu)勢(shì),。生物反應(yīng)器培養(yǎng)可獲得更高的收益率，生物反應(yīng)器的控制系統(tǒng)可以完成更多工作,，可監(jiān)測(cè)和控制的參數(shù)數(shù)量基于生物反應(yīng)器中的傳感器和控制元件數(shù)量,，可以更好的進(jìn)行培養(yǎng)工藝條件的篩選，優(yōu)化,。工藝簡(jiǎn)單,、操作靈活，有良好的適用性,；培養(yǎng)工藝容易放大,，可為生物體生長(zhǎng)和增殖提供均質(zhì)的環(huán)境；產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定,，非常適合工業(yè)化生產(chǎn),；管路布置較為簡(jiǎn)單，能提供較好的無(wú)菌條件,，細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中不易污染,。該研究在30 L生物反應(yīng)器規(guī)模實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，實(shí)現(xiàn)了在150 L生物反應(yīng)器進(jìn)行微載體濃度20 g/L的Vero細(xì)胞培養(yǎng),，并接種RABV,，細(xì)胞病變過(guò)程正常且可控，病毒收獲液滴度最高可達(dá)8.5 lg LD50/m L, 30和150 L生物反應(yīng)器培養(yǎng)的終末代細(xì)胞各項(xiàng)檢測(cè)均符合《中國(guó)藥典》三部(2020版)要求,，為后期開(kāi)發(fā)更大規(guī)模高密度微載體生物反應(yīng)器工藝奠定基礎(chǔ),。

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　　艾貝泰生物科技有限公司(Applitech Biological Technology Co., Ltd.)作為一家集設(shè)計(jì),、研發(fā)、生產(chǎn),、銷(xiāo)售和服務(wù)于一體的高新技術(shù)企業(yè),，致力于為生物制藥領(lǐng)域提供專(zhuān)業(yè)的生產(chǎn)及分析設(shè)備、一次性耗材和整體解決方案,。從成立至今,，我們始終以客戶(hù)為中心，將“質(zhì)量為本,，服務(wù)為先”作為經(jīng)營(yíng)方針,，立足于生物工藝的優(yōu)化、放大和生產(chǎn),，不斷完善生物制藥領(lǐng)域的產(chǎn)品線(xiàn),，為用戶(hù)提供生物工藝的專(zhuān)業(yè)解決方案，助力用戶(hù)在生物制藥領(lǐng)域不斷取得新的突破,。

　　艾貝泰深耕生物反應(yīng)器領(lǐng)域?qū)⒔?0年,，立志打造自主生物反應(yīng)器。我們的生物反應(yīng)器覆蓋從研發(fā),、中試以及cGMP生產(chǎn)多領(lǐng)域,，廣泛應(yīng)用于抗體、疫苗,、細(xì)胞治療,、基因治療以及干細(xì)胞治療等領(lǐng)域的研發(fā)及生產(chǎn)。以生物反應(yīng)器為業(yè)務(wù)核心,，我們逐步形成涵蓋過(guò)程檢測(cè),、光譜分析、細(xì)胞分析,、在線(xiàn)取樣,、樣品處理等的產(chǎn)品布局，為國(guó)內(nèi)外生物制藥企業(yè)提供了廣泛的產(chǎn)品與技術(shù)服務(wù),。

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