小鼠黃體生成素釋放激素(LHRH）elisa試劑盒產(chǎn)品說明書產(chǎn)品說明書

小鼠黃體生成素釋放激素(LHRH）elisa試劑盒實(shí)驗(yàn)原理

小鼠黃體生成素釋放激素(LHRH）ELISA試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）,。往預(yù)先包被小鼠黃體生成素釋放激素(LHRH）捕獲抗體的包被微孔中，依次加入標(biāo)本,、標(biāo)準(zhǔn)品,、HRP標(biāo)記的檢測抗體,，經(jīng)過溫育并徹di洗滌。用底物TMB顯色,，TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色,，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的小鼠黃體生成素釋放激素(LHRH）呈正相關(guān),。用酶標(biāo)儀在450nm 波長下測定吸光度（OD 值）,，計(jì)算樣品濃度。

樣本處理及要求

1.  血清：將收集于血清分離管的全血標(biāo)本在室溫放置2小時(shí)或4℃過夜,，然后1000×g離心20 分鐘,，取上清即可，或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80℃保存,，但應(yīng)避免反復(fù)凍融,。
2.  血漿：用EDTA或肝素作為抗凝劑采集標(biāo)本，并將標(biāo)本在采集后的30分鐘內(nèi)于2-8℃ 1000×g離心15分鐘,，取上清即可檢測,，或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融,。
3. 組織勻漿：用預(yù)冷的PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織,，去除殘留血液（勻漿中裂解的紅細(xì)胞會(huì)影響測量結(jié)果），稱重后將組織剪碎,。將剪碎的組織與對應(yīng)體積的PBS（一般按1:9的重量體積比,，比如1g的組織樣品對應(yīng)9mL的PBS，具體體積可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要適當(dāng)調(diào)整，并做好記錄,。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑）加入玻璃勻漿器中,，于冰上充分研磨。為了進(jìn)一步裂解組織細(xì)胞,，可以對勻漿液進(jìn)行超聲破碎,，或反復(fù)凍融。最后將勻漿液于5000×g離心5~10分鐘,，取上清檢測,。

4. 細(xì)胞培養(yǎng)物上清或其它生物標(biāo)本：請1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測,，或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80℃保存,，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

注：標(biāo)本溶血會(huì)影響最后檢測結(jié)果,，因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測,。

需要而未提供的試劑盒器材

1.酶標(biāo)儀（450nm）

2.高精度加樣器及槍頭：0.5-10uL、2-20uL,、20-200uL,、200-1000uL

3.37℃恒溫箱

4.蒸餾水或去離子水

備注：

1、標(biāo)準(zhǔn)品濃度依次為：詳見說明書,；

2、經(jīng)過大量正常標(biāo)本檢驗(yàn),，標(biāo)本的正常濃度值均在試劑盒提供的檢測范圍內(nèi),，實(shí)驗(yàn)過程中直接取50μL樣本上樣即可。當(dāng)有部分樣本值超過最大標(biāo)準(zhǔn)品濃度時(shí),，可用樣本稀釋液將標(biāo)本進(jìn)行適當(dāng)稀釋后再進(jìn)行實(shí)驗(yàn),。

注意事項(xiàng)

1、嚴(yán)格按照規(guī)定的時(shí)間和溫度進(jìn)行溫育以保證準(zhǔn)確結(jié)果,。所有試劑都必須在使用前達(dá)到室溫20-25℃,。使用后立即冷藏保存試劑。

2,、洗板不正確可以導(dǎo)致不準(zhǔn)確的結(jié)果,。在加入底物前確保盡量吸干孔內(nèi)液體。溫育過程中不要讓微孔干燥掉,。

3,、消除板底殘留的液體和手指印，否則影響OD值,。

4,、底物顯色液應(yīng)呈無色或很淺的顏色，已經(jīng)變藍(lán)的底物液不能使用。

5,、避免試劑和標(biāo)本的交叉污染以免造成錯(cuò)誤結(jié)果,。

6、在儲(chǔ)存和溫育時(shí)避免強(qiáng)光直接照射,。

7,、平衡至室溫后再打開密封袋以防水滴凝聚在冷板條上。

8,、任何反應(yīng)試劑不能接觸漂白溶劑或漂白溶劑所散發(fā)的強(qiáng)烈氣體,。任何漂白成分都會(huì)破壞試劑盒中反應(yīng)試劑的生物活性。

9,、不能使用過期產(chǎn)品,。

10、如果可能傳播疾病,，所有的樣品都應(yīng)管理好,，按照規(guī)定的程序處理樣品和檢測裝置。

試劑準(zhǔn)備

試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡后方可使用,。

20×洗滌緩沖液的稀釋：蒸餾水按1：20稀釋,，即1份20×洗滌緩沖液加19份蒸餾水。

操作步驟

1.從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條,，剩余板條用自封袋密封放回4℃,。

2. 設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μL,；

3.樣本孔中加入待測樣本50μL,；空白孔不加。

4. 除空白孔外,，標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的檢測抗體100μL,，用封板膜封住反應(yīng)孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min,。

5. 棄去液體,，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液（350μL）,，靜置1min,，甩去洗滌液，吸水紙上拍干,，如此重復(fù)洗板5次（也可用洗板機(jī)洗板）,。

6.每孔加入底物A、B各50μL,，37℃避光孵育15min,。

7.每孔加入終止液50μL,，15min內(nèi)，在450nm波長處測定各孔的OD值,。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)算

以所測標(biāo)準(zhǔn)品的OD值為橫坐標(biāo),，標(biāo)準(zhǔn)品的濃度值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上或用相關(guān)軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,，并得到直線回歸方程,，將樣品的OD值代入方程，計(jì)算出樣品的濃度,。

試劑盒性能

1,、檢測范圍：詳見產(chǎn)品說明書,。

2,、靈敏度：詳情見說明書。

3,、特異性：不與其它可溶性結(jié)構(gòu)類似物交叉反應(yīng),。

4,、重復(fù)性：板內(nèi)變異系數(shù)小于10% ，板間變異系數(shù)小于15% ,。