小鼠生長激素釋放肽ghrelin(GHRP-Ghrelin）elisa試劑盒使用說明書使用說明書

小鼠生長激素釋放肽ghrelin(GHRP-Ghrelin）elisa試劑盒實驗原理

小鼠生長激素釋放肽ghrelin(GHRP-Ghrelin）ELISA試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）。往預先包被小鼠生長激素釋放肽ghrelin(GHRP-Ghrelin）捕獲抗體的包被微孔中，依次加入標本、標準品,、HRP標記的檢測抗體，經(jīng)過溫育并徹di洗滌。用底物TMB顯色,，TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成最終的黃色,。顏色的深淺和樣品中的小鼠生長激素釋放肽ghrelin(GHRP-Ghrelin）呈正相關,。用酶標儀在450nm 波長下測定吸光度（OD 值）,，計算樣品濃度。

樣本處理及要求

1.  血清：將收集于血清分離管的全血標本在室溫放置2小時或4℃過夜,，然后1000×g離心20 分鐘,，取上清即可，或將上清置于-20℃或-80℃保存,，但應避免反復凍融,。
2.  血漿：用EDTA或肝素作為抗凝劑采集標本，并將標本在采集后的30分鐘內于2-8℃ 1000×g離心15分鐘,，取上清即可檢測,，或將上清置于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融,。
3. 組織勻漿：用預冷的PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織,，去除殘留血液（勻漿中裂解的紅細胞會影響測量結果），稱重后將組織剪碎,。將剪碎的組織與對應體積的PBS（一般按1:9的重量體積比,，比如1g的組織樣品對應9mL的PBS，具體體積可根據(jù)實驗需要適當調整,，并做好記錄,。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑）加入玻璃勻漿器中，于冰上充分研磨,。為了進一步裂解組織細胞,，可以對勻漿液進行超聲破碎，或反復凍融,。最后將勻漿液于5000×g離心5~10分鐘,，取上清檢測。

4. 細胞培養(yǎng)物上清或其它生物標本：請1000×g離心20分鐘,，取上清即可檢測,，或將上清置于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融,。

注：標本溶血會影響最后檢測結果,，因此溶血標本不宜進行此項檢測。

需要而未提供的試劑盒器材

1.酶標儀（450nm）

2.高精度加樣器及槍頭：0.5-10uL,、2-20uL,、20-200uL、200-1000uL

3.37℃恒溫箱

4.蒸餾水或去離子水

備注：

1,、標準品濃度依次為：詳見說明書,；

2、經(jīng)過大量正常標本檢驗,，標本的正常濃度值均在試劑盒提供的檢測范圍內,，實驗過程中直接取50μL樣本上樣即可,。當有部分樣本值超過最大標準品濃度時，可用樣本稀釋液將標本進行適當稀釋后再進行實驗,。

注意事項

1,、嚴格按照規(guī)定的時間和溫度進行溫育以保證準確結果。所有試劑都必須在使用前達到室溫20-25℃,。使用后立即冷藏保存試劑,。

2、洗板不正確可以導致不準確的結果,。在加入底物前確保盡量吸干孔內液體,。溫育過程中不要讓微孔干燥掉。

3,、消除板底殘留的液體和手指印,，否則影響OD值。

4,、底物顯色液應呈無色或很淺的顏色,，已經(jīng)變藍的底物液不能使用。

5,、避免試劑和標本的交叉污染以免造成錯誤結果,。

6、在儲存和溫育時避免強光直接照射,。

7,、平衡至室溫后再打開密封袋以防水滴凝聚在冷板條上。

8,、任何反應試劑不能接觸漂白溶劑或漂白溶劑所散發(fā)的強烈氣體,。任何漂白成分都會破壞試劑盒中反應試劑的生物活性。

9,、不能使用過期產(chǎn)品,。

10、如果可能傳播疾病,，所有的樣品都應管理好,，按照規(guī)定的程序處理樣品和檢測裝置。

試劑準備

試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應在室溫平衡后方可使用,。

20×洗滌緩沖液的稀釋：蒸餾水按1：20稀釋,，即1份20×洗滌緩沖液加19份蒸餾水。

操作步驟

1.從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條,，剩余板條用自封袋密封放回4℃,。

2. 設置標準品孔和樣本孔，標準品孔各加不同濃度的標準品50μL；

3.樣本孔中加入待測樣本50μL,；空白孔不加,。

4. 除空白孔外，標準品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的檢測抗體100μL,，用封板膜封住反應孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min,。

5. 棄去液體,，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液（350μL）,，靜置1min,，甩去洗滌液，吸水紙上拍干,，如此重復洗板5次（也可用洗板機洗板）,。

6.每孔加入底物A、B各50μL,，37℃避光孵育15min,。

7.每孔加入終止液50μL，15min內,，在450nm波長處測定各孔的OD值,。

實驗結果計算

以所測標準品的OD值為橫坐標，標準品的濃度值為縱坐標,，在坐標紙上或用相關軟件繪制標準曲線,，并得到直線回歸方程，將樣品的OD值代入方程,，計算出樣品的濃度,。

試劑盒性能

1、檢測范圍：詳見產(chǎn)品說明書,。

2,、靈敏度：詳情見說明書。

3,、特異性：不與其它可溶性結構類似物交叉反應,。

4、重復性：板內變異系數(shù)小于10% ,，板間變異系數(shù)小于15% ,。