--細 胞 基 本 信 息---

細胞名稱： J774A.1(小鼠單核巨噬細胞)

細胞別稱： J-774A.1; J774.A1; J774 A1; J774A.1; J 774A.1; J774 A.1

細胞貨號： SNL-333

生長特性： 半貼壁細胞

培養(yǎng)條件： DMEM+10% FBS+1% P/S

培養(yǎng)環(huán)境： 空氣，95%,； 二氧化碳 (CO₂),，5%,；37℃

細胞簡介： J774A.1細胞是1968年從患有網狀細胞肉瘤的成年雌性 BALB/cN小鼠腹水中分離的,。J774A.1細胞有抗體依賴的吞噬作用,，生長受硫酸葡聚糖,、PPD和LPS的抑制。J774A.1細胞可產生IL-1β和大量的溶菌酶,。

細胞正常生長形態(tài)照片

J774A.1細胞培養(yǎng)注意事項

1. 細胞半貼壁圓形或多角形生長,，部分懸浮圓形，傳代時均可收集培養(yǎng),，換液時將懸浮細胞離心收集后重新接回原瓶,，若貼壁細胞較多活性較好時可以不要懸浮的細胞。

2. J774A.1細胞對胰蛋白酶敏感,，接觸胰酶后將發(fā)生自發(fā)分化,，貼壁變緊，很難消化下來,。所以不建議用胰酶對該細胞進行傳代。（詳細傳代步驟見下文）

3. J774A.1細胞生長速度較快,，消耗營養(yǎng)也較快,。建議每天觀察細胞密度，當細胞密度到達80%時及時進行傳代,，以防細胞過度生長狀態(tài)變差,。密切關注培養(yǎng)基顏色，當培養(yǎng)基有變黃趨勢時及時換液,，以防營養(yǎng)不夠導致細胞狀態(tài)變差,。

J774A.1細胞傳代方法

1. 準備所需的培養(yǎng)基、胰酶,、PBS,、離心管、培養(yǎng)瓶以及無菌槍頭等,；（試劑提前預熱）

2. 輕輕吸走培養(yǎng)上清,，留 2-3mL 培養(yǎng)基輕輕吹打細胞面吹下細胞；

2. 將細胞懸液轉移至離心管,，900rpm 離心 3-5min,，棄上清；

3. 加新的完quan培養(yǎng)基輕輕重懸細胞,，均勻分到新的培養(yǎng)瓶里,；

4. 補足完quan培養(yǎng)基，將培養(yǎng)瓶放回培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng),。

Tips：

1. 吹打次數不宜過多,，吹打力度保持輕柔，以免機械刺激造成細胞自分化或損傷,。

2. 推薦使用1mL吸頭進行吹打

J774A.1細胞凍存方法

1. 配制程序性凍存液,，準備相應數量凍存管并做好標記,。

Tips：推薦凍存液配方92%FBS+8%DMSO或92%完quan培養(yǎng)基+8%DMSO

2. 先將細胞按傳代步驟獲得細胞沉淀；

3. 加入適量程序性凍存液輕輕重懸細胞,，并將細胞懸液轉移至凍存管中,；

4. 將凍存管放入程序性凍存盒，放入-80℃冰箱過夜,；

5. 轉移凍存細胞至液氮保存并登記細胞保存位置,。

Tips：

l 液氮保存24h后建議復蘇一管檢測凍存細胞的活性，若活性合格即可長期保存,。

l 程序性凍存液需要配合程序性凍存盒使用,，若使用非程序凍存液請按產品說明書處理降溫過程。

l T25培養(yǎng)瓶長滿通?？蓛龃?-3管,，10cm皿長滿通常可凍存3-4管,。

l 凍存密度低將導致復蘇后細胞狀態(tài)不佳,。

J774A.1細胞復蘇方法

1. 提前將水浴鍋預熱至37℃，培養(yǎng)基復溫至室溫或37℃,，離心機設置好轉速,；

2. 將細胞從液氮罐中取出，觀察管內無液氮的情況下,，捏住管蓋,，將細胞凍存部分浸入水浴鍋迅速搖晃，細胞融化至米粒大小冰塊時終止水浴,，融化過程不超過2min,；

Tips：

l 若液氮或冰箱距離細胞房較遠，細胞需要放在干冰或冰盒上運送至細胞房,。

l 凍存管在液氮長期保存過程中難免滲入液氮,，取出細胞時震動不要過大。水浴前一定要觀察管內是否存在液氮,，若有液氮需靜置一會待液氮完quan蒸發(fā)后再水浴,。做好防護，避免凍存管炸開導致受傷,。

l 水浴時使用一次性PE手套包住凍存管避免直接接觸水源,，避免污染。

3. 直接將凍存管以離心力150g(約900rpm)左右離心2min,，不同離心機具體轉速會有差異

4. 離心完成后棄上清,，用預熱的培養(yǎng)基緩慢加入凍存管，輕柔重懸細胞后接種至培養(yǎng)瓶中，輕輕混勻后放入培養(yǎng)箱,；

5. 復蘇24小時后觀察細胞貼壁情況,。

Tips：整個細胞復蘇過程在盡可能5-10min內完成。

J774A.1細胞收貨攻略

l 常溫細胞

1. 收貨后,，拆開外包裝,，用75%酒精消毒T25瓶表面，放37℃培養(yǎng)箱靜置4h以上,；

2. 吸走大部分培養(yǎng)基并留10-12 mL,，顯微鏡下拍照保存細胞狀態(tài)照片，觀察細胞密度,，若細胞密度大于80%即可按比例傳代（首ci傳代比例建議1：2）,，若細胞密度低于70%可以留10-12 mL繼續(xù)培養(yǎng)至細胞密度80%以上再進行傳代培養(yǎng)；

Tips：若收貨時發(fā)現懸浮細胞較多,，應離心收集懸浮細胞并放回原瓶

l 凍存細胞

1. 細胞收貨后盡快開箱檢查,，若干冰充足可以取出細胞迅速置于-80℃冰箱（2-3天內復蘇）短期保存或液氮中長期保存，若干冰完quan揮發(fā)建議立即復蘇細胞并聯(lián)系銷售人員解決,；

2. 凍存細胞建議盡快復蘇一管培養(yǎng)檢查,，以免超出售后期，復蘇步驟參考復蘇攻略,；

3. 復蘇一管細胞出現異常及時聯(lián)系銷售人員，在專業(yè)技術支持的指導下進行下一步操作,；

Tips：

1. 細胞收貨出現漏液,、培養(yǎng)瓶破損、干冰完quan揮發(fā)等異常情況時,，及時拍照聯(lián)系銷售人員,；

2. 尚恩生物T25瓶發(fā)貨的細胞內含對應細胞的完quan培養(yǎng)基，可以收集原裝培養(yǎng)瓶內培養(yǎng)基經1500rpm離心5min后,，取上清于4℃保存用于后續(xù)細胞培養(yǎng),；

常見問題及解決方案

細胞密度怎么計算的？

嚴格意義上,，細胞密度需要收集細胞懸液計數細胞數量,，但在實際培養(yǎng)過程中，并不需要為了精確控制細胞數量而消化細胞計數,。因此,，常用的細胞密度指細胞相對于最大生長密度的比值，貼壁細胞可以粗略的用細胞所占培養(yǎng)容器底面積百分比表示,，即顯微鏡下觀察培養(yǎng)容器底部,，有細胞的區(qū)域占總區(qū)域的百分比值，當然這種表達方式受限于單個細胞生長不同密度時所占面積不同導致并不嚴謹，但也是相當直觀,、簡便的表現細胞狀態(tài)的一種方式,。

NO.2培養(yǎng)過程中細胞碎片較多怎么處理？

1. 細胞內的黑色顆粒是細胞外分泌泡及細胞器折光,，這個屬于細胞自身特性,，無法清除也無法改變，大部分細胞都會有這種現象,，只是不同細胞顆粒多少有區(qū)別,，細胞培養(yǎng)體系不適應、營養(yǎng)缺乏,、滲透壓異常等均可能導致細胞內顆粒增加,，建議使用合適的培養(yǎng)條件。

2. 細胞外的黑色顆粒大部分是細胞碎片和細胞代謝產物,，可以先吸走培養(yǎng)基后用PBS潤洗清除,，再加新的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。潤洗不能清除的可以換液清洗后等細胞密度70-80%左右消化處理細胞,，消化完成后加完quan培養(yǎng)基終止消化,，混勻細胞，收集細胞懸液900-1000rpm(約150g)離心3min,，棄上清,。再加5mL PBS重懸細胞，再離心后,，用完quan培養(yǎng)基重懸接種到新的培養(yǎng)皿,。第二次PBS重懸是為了去除碎片，如果平時碎片比較少,，傳代時可以省略PBS重懸的步驟,；如果碎片很多，建議PBS多洗幾次,。

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