細胞轉(zhuǎn)染在科學研究中扮演著十分重要的角色，但也是最容易被忽略的一環(huán),。轉(zhuǎn)染效率的高低不僅影響實驗結果,，甚至可能導致得到的實驗結果是無效的。在多種類型核酸的細胞轉(zhuǎn)染實驗中，研究者們常需要進一步優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件以達到轉(zhuǎn)染效率,，特別是較難轉(zhuǎn)染的細胞,，而針對特定細胞類型選擇對應專業(yè)化的轉(zhuǎn)染試劑只是邁向轉(zhuǎn)染實驗成功的第一步。

成立于1995年的Mirus Bio,，專注及深耕核酸遞轉(zhuǎn)領域多年,，從最早具有低毒性的TransIT ® -LT1到GMP級別、可用于AAV和LV生產(chǎn)的TransIT-VirusGEN® (產(chǎn)品年鑒請見圖1),。直至文稿發(fā)布時,，使用Mirus產(chǎn)品發(fā)表文章已超過1萬篇，并且發(fā)表文章及Mirus數(shù)據(jù)庫涵蓋了超過1200種細胞類型,。

圖1 Mirus產(chǎn)品年鑒

在細胞轉(zhuǎn)染實驗中,，研究者們常常會忽略轉(zhuǎn)染效率/成功率的評估，那么是否有對應技術或者方法允許實時監(jiān)測DNA/RNA的成功遞送以及細胞內(nèi)的分布狀態(tài)呢,？Mirus Bio Label IT® 核酸標記試劑盒為廣大的科研工作者提供了一個方向,。Label IT® 核酸標記試劑盒可對任何類型核酸，進行高效,、直接的標記,，并且為on-step的實驗操作?；诜敲阜磻臉擞浄椒?，在不損傷核酸完整性、不影響基因表達的前提下,，將選擇的標記 (熒光、生物素等)以共價的方式連接到核酸上,。

Label IT® 試劑盒有多種標簽可供選擇,，包括 Cy®3、Cy®5,、CX-羅丹明,、TM-羅丹明、熒光素,、MFP488,、生物素和二硝基苯基(DNP)。Label IT® 核酸修飾試劑盒（胺）也可用于基于胺的功能基團進行DNA或RNA修飾,。產(chǎn)品特點如下：

·        可用于標記任何DNA或RNA模板——適用于多種應用 (In vitro & in vivo),，如Crispr基因編輯、核酸遞轉(zhuǎn),、RNA干擾/表達實驗,、FISH、Microarray等；

·        一步法標記——簡單,、輕松即可完成穩(wěn)定的模版標記反應,；

·        可根據(jù)實驗需求或應用，調(diào)節(jié)標記的密度——以獲得最佳檢測標記 DNA 或RNA 的靈敏度,；

·        基于共價化學反應——對核酸殘基的修飾為無損傷的,，是多種科研應用的理想選擇。

·        什么是核酸標記,？如何標記核酸,？如何檢測？

絕大多數(shù)基于分子和生物學的In vitro 及 in vivo研究都依賴于核酸的標記或標簽,，理想情況下,，此類標記或標簽不會影響核酸功能以及研究結果。因此,，也發(fā)展出來多種核酸標記方式,，大致可以歸為以下兩類：

-        化學標記法：基于結合核酸的反應基團，比如Mirus Label IT® 核酸標記試劑盒屬于此類,，并且整個反應過程并不需要酶的參與,。

Label IT® 化學標記試劑由三個部分組成（如圖2）：

(1)    標簽/標記 (綠色區(qū)域)；

(2)    Linker,，與核酸進行靜電相互作用 (黃色區(qū)域),；

(3)    Label IT® 試劑以共價形式連接到核酸中活性雜原子的烷基化基團(藍色區(qū)域)。

圖2. Label IT®標記分子示意圖

-        基于酶反應標記法：通過酶促反應,，在該反應過程中加入標記修飾的核酸,。

當待研究的核酸加入標記后，可通過以下兩種方式進行檢測：

-        直接檢測：這時,，標記的核酸中包含了可用于光學,、發(fā)光或產(chǎn)生熒光信號的報告分子。

-        間接檢測：標記的核酸帶有標簽或標記,，該標記需要特異性的結合報告偶聯(lián)分子,，如生物素結合帶有熒光標記的鏈霉親和素，結合帶有熒光標記的特異性抗體等,。

·        Label IT® 核酸標記試劑盒——不改變核酸結構功能

基因沉默相關功能研究在分子和細胞生物學中發(fā)揮著重要作用,，化學轉(zhuǎn)染也在該研究領域扮演者重要角色。小干擾 RNA (Small interfering RNAs, siRNA),，常作為研究各種類型細胞中蛋白功能核酸類型,，通過有效的knockdown從而影響基因表達。那么,，加入Label IT®標記的核酸,，是否會改變核酸結構，從而影響到后續(xù)實驗結果呢？

評估測試使用Label IT® siRNA Tracker™ 試劑盒,，將相同siRNA加入不同標記 (Cy^TM3, Cy^TM5, 熒光素, CX-羅丹明 )以及沒有標記siRNA,，轉(zhuǎn)染后，可通過熒光顯微鏡觀察到帶有標記的siRNA,?；虮磉_結果顯示，帶有不同標記的siRNA,，其目的基因表達水平近似,，意味著加入Label IT®標記的核酸，并不影響目的基因表達及功能 (圖3),。

圖3  Label IT® siRNA Tracker™ 試劑盒評估測試

·        Label IT® 核酸標記試劑盒——前沿應用舉例

應用一：使用Label IT®技術,，富集CRISPR'd細胞

Nasri 和 Mir 等人在文章中闡述了如何通過 Label IT® 技術，富集 CRISPR/Cas編輯成功的細胞,?；蚪M編輯實驗面臨最大的挑戰(zhàn)之一是如何從未編輯的細胞中成功的篩選/富集出成功編輯的細胞，特別當未被編輯的細胞相對于成功編輯的細胞,，具有生長/增殖優(yōu)勢,，使得細胞篩選變得更加困難。

為了高效的區(qū)分經(jīng)過基因編輯及未編輯的細胞,，作者在CRISPR引導RNA ( gRNA) 與 Cas9 形成復合物及轉(zhuǎn)染細胞前,，使用Label IT®對gRNA進行了熒光標記，實驗流程示意圖如下：

研究結果表明,，使用Label IT®標記的gRNA 不會影響基因編輯效率,，并且可通過熒光分選/富集成功編輯的細胞群。進一步地,，研究者們將該 CRISPR 實驗流程應用于針對多種細胞類型的GADD45B基因編輯實驗,。根據(jù)細胞類型的不同，經(jīng)過Label IT®標記的細胞亞群中,，其成功編輯細胞占比相對于總細胞群體提了15-40%,。

發(fā)表文章信息：

標題: Fluorescent labeling of CRISPR/Cas9 RNP for gene knockout in HSPCs and iPSCs reveals an essential role for GADD45b in stress response
作者: Masoud Nasri, Perihan Mir et al.
雜志: Blood Adv, Volume 3(1), Jan 2019.
DOI: 10.1182/bloodadvances.2017015511

應用二：使用Label IT®技術,，聚焦于免疫系統(tǒng)研究

Label IT® 核酸標記技術可用于一種新型疫苗注射方法-微針陣列(microneedle array, MNA)的表征研究,。傳統(tǒng)的疫苗注射方法是通過 3 厘米以上長度的針頭進行皮下注射，而微針陣列則是由微米級針頭所組成(示意圖如下),，以無痛的方式細微的的穿透皮膚,，進入到富含免疫細胞群，可減少患者的不適感,。

為了提高疫苗的效力(efficacy),，通常會將免疫刺激分子或 "激動劑(agonists) "與疫苗的靶標或抗原一同加入疫苗制劑中。Edwards 等人的研究表明，雙鏈 polyIC RNA 和單鏈 CpG DNA 寡核苷酸可作為微陣列中的激動劑(agonists),。并且,，研究者們認為帶負電荷的核酸激動劑(agonists)和帶正電荷的抗原之間的靜電相互作用，幫助了微陣列的組裝,。通過使用 Label IT® Cy®3 和 Cy®5 ,，分別針對以上兩種核酸類型進行熒光標記，方便用于查看標記核酸在微針上的分布,，這樣就允許了研究者們按照所需要的特定比例,，將兩種激動劑均一的加入到微陣中，從而使得精確的調(diào)整微針陣列 MNA 疫苗的免疫反應成為可能,。

發(fā)表文章信息：

標題: Tuning innate immune function using microneedles containing multiple classes of toll-like receptor agonists
作者: Camilla Edwards, Robert Oakes et al.
雜志: Nanoscale, Volume 15, Apr 2023.
DOI: 10.1039/D3NR00333G

·        Label IT® 核酸標記試劑盒-產(chǎn)品選擇

Label IT®試劑盒共有以下四種形式可供選擇,，以應對研究人員核酸標記實驗的不同應用場景需求：

·        Label IT® Nucleic Acid Labeling Kits

·        Label IT®Tracker™ Intracellular Nucleic Acid Localization Kits

·        Label IT® siRNA Tracker™ Intracellular Localization Kits

·        Label IT® Nucleic Acid Modifying Kits

下表總結了不同種類Label IT®試劑盒區(qū)別： 

·        更多有關產(chǎn)品常疑問FAQ，請查看鏈接

·        Label IT® 核酸標記試劑盒-實驗優(yōu)化之核酸標記密度

理想的密度取決于被標記的核酸類型及下游應用,。在需要直接追蹤核酸的實驗中,，更適合較高的核酸標記密度；而在想要維持/完整的還原標記核酸的生物學功能的實驗中,，則更加適合較低的標記密度,。使用 Label IT® 核酸標記技術，可以輕松調(diào)整到理想的標記密度,。

Label IT® 試劑與核酸的比例(v:w)的改變與標記密度呈線性相關性(圖 4),。例如，按照說明的初次實驗建議,，需加入 5 µl Label IT® 試劑標記 5 µg DNA,，此時v:w比例為1:1。在保證孵育時間和 DNA 量不變的條件下,，如將 Label IT® 試劑的量降低為 2.5 µl 或 增加到10 µl,，標記密度將分別降低一半或增加一倍。

實驗Tips：使用過高的 Label IT® 試劑量（超過建議量的 4 倍）,，可能會導致核酸裂解或引起 Label IT® 熒光基團淬滅,。

核酸標記密度與所使用的 Label IT® 試劑量及反應的孵育時間呈正線性相關?？赏ㄟ^調(diào)整反應中 Label IT® 試劑的用量或反應的孵育時間 (孵育溫度仍為37℃),，可輕松靈活的調(diào)整到所需要的理想標記密度。

圖4. 核酸標記密度與Label IT®試劑用量和反應孵育時間成正比

實驗Tips：如何計算核酸標記密度,，詳細實驗步驟及方法請見“Calculate Nucleic Acid Labeling Density”,。

Mirus Bio公司介紹

Mirus成立于1995年，始終秉承著為基因遞轉(zhuǎn)提供最佳方法及更高效的工具,。憑借超過 25 年轉(zhuǎn)染領域的深根細作,，獲得了多項技術突破,，已成為核酸遞送領域值得信賴的品牌。Mirus科學家團隊不斷突破轉(zhuǎn)染技術的極限,，推出了VirusGEN®轉(zhuǎn)染試劑與RevIT™增強劑,，進一步提升AAV/Lv產(chǎn)量，助力推動生物治療藥物的降本增效,，為CGT領域客戶賦能,。

 北京西美杰科技有限公司是Mirus中國區(qū)總代理，始終秉承著專業(yè),、嚴謹?shù)膽B(tài)度為客戶提供優(yōu)質(zhì)的產(chǎn)品與服務,，Mirus熱銷轉(zhuǎn)染產(chǎn)品常備現(xiàn)貨。北京西美杰是 Mirus代理,， Mirus中國代理,， Mirus北京代理， Mirus總代理,， Mirus上海代理,，， Mirus西北代理,， Mirus西南代理,， Mirus東北代理， Mirus華北代理,， Mirus華南代理,， Mirus華中代理，負責 Mirus在中國的相關業(yè)務,。