本篇繼上一篇“實(shí)用建議：“如何合理設(shè)計(jì)穩(wěn)定的凍干蛋白配方（一）”繼續(xù)為大家分享蛋白樣品凍干的理想賦形劑有哪些,、基于成功蛋白凍干配方會(huì)導(dǎo)致Final失敗的一些細(xì)節(jié)問題等,。

》》》對(duì)于蛋白樣品,，理想的賦形劑有哪些,？

從凍干對(duì)蛋白的所有危險(xiǎn)以及我們需要在各個(gè)環(huán)節(jié)考慮的所有因素來看,，快速開發(fā)一個(gè)穩(wěn)定的蛋白配方看起來似乎是不可能的,。幸運(yùn)的是,，如果我們能夠采用合理的方法對(duì)配方進(jìn)行很好的設(shè)計(jì)，大多數(shù)的配方問題是可以得到快速解決,。

這里,，我們主要是對(duì)初始配方成分的選擇提供基礎(chǔ),。在一些情況下,，初始的配方很有可能就是走向市場(chǎng)的Final產(chǎn)品。給定的組分，進(jìn)行不同微小的修改,，已經(jīng)被成功地用于蛋白藥物,。需要強(qiáng)調(diào)的是對(duì)于凍干配方，在能夠提供良好穩(wěn)定性和結(jié)構(gòu)的情況下,，成分越簡(jiǎn)單越好,。所加入的賦形劑都須要有數(shù)據(jù)證明對(duì)配方起有益的作用。

01給定蛋白質(zhì)維持穩(wěn)定性的具體條件

對(duì)于一些通用型的穩(wěn)定劑,，可以有效地保護(hù)絕大多數(shù)的蛋白質(zhì),，在選擇這些穩(wěn)定劑之前，我們有必要通過優(yōu)化影響蛋白物理和化學(xué)穩(wěn)定性的具體因素來選擇合適的穩(wěn)定劑,。

影響蛋白物理和化學(xué)穩(wěn)定性的具體因素：

1. 避免偏激的pH值可以顯著降低蛋白脫氨基的幾率,。而且，通過優(yōu)化溶液的pH值,，可以顯著提高蛋白在凍干過程中抵抗去折疊的能力,。

2. 還應(yīng)該研究其他能提高蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的特異性配體（通過增加去折疊的自由能）。肝素和其他聚陰離子對(duì)生長(zhǎng)因子的穩(wěn)定性影響就是一個(gè)很好的例子,。

3. 其它需要考慮的重要因素是離子強(qiáng)度對(duì)蛋白的去折疊和聚合的影響,。須意識(shí)到，在預(yù)凍過程中,，由于冰的形成將溶液濃縮,，離子強(qiáng)度可增加50倍。因此負(fù)責(zé)原料藥純化和做藥物配方前研究的人員已經(jīng)對(duì)這些問題有了深刻的認(rèn)識(shí),，配方科學(xué)家應(yīng)該在著手設(shè)計(jì)凍干配方之前與他們進(jìn)行溝通,。

即使在針對(duì)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性優(yōu)化的特定的溶液條件下，但是如果樣品需要幸免于凍干的損害并長(zhǎng)期保存,，有必要加入一些其它的保護(hù)劑,。首先，我們考慮一些已經(jīng)用在凍干蛋白配方中的成分,，但它們不能提供蛋白的穩(wěn)定性,，而且可能會(huì)促進(jìn)蛋白在儲(chǔ)存期間的破壞。我們將提供一個(gè)簡(jiǎn)單,、有效的思路,，并且討論選擇這些成分的原理。

02不能提供蛋白穩(wěn)定性的賦形劑

部分多聚物作為賦形劑的優(yōu)缺點(diǎn)

在凍干工藝的快速開發(fā)過程中,，為了獲得一個(gè)強(qiáng)壯的蛋糕結(jié)構(gòu),，一些多聚物，如葡聚糖,，氨基乙基乙醇胺淀粉,，因具有較高的塌陷溫度,，導(dǎo)致Final產(chǎn)品的Tg也會(huì)比較高，常常是受歡迎的賦形劑,。

不好的是,，這些多聚物在凍干過程中不能抑制蛋白結(jié)構(gòu)的去折疊，因此在后續(xù)的儲(chǔ)存中不能提供穩(wěn)定性,。無法抑制凍干誘導(dǎo)變性的原因大概是聚合物過大而無法與蛋白質(zhì)氫鍵合,，無法代替脫水過程中損失的水，或者是因?yàn)榫酆衔锱c蛋白質(zhì)形成了分離的無定形相,。盡管當(dāng)這些多聚物單獨(dú)使用時(shí)不是一種很好的穩(wěn)定劑,，但是經(jīng)證實(shí)，如果其結(jié)合雙糖穩(wěn)定劑可以具有較好好的作用,。

凍干過程中的有效穩(wěn)定劑

對(duì)大量的化合物進(jìn)行測(cè)定,，顯示在凍干過程在較有效的穩(wěn)定劑是雙糖，但是避免使用還原性糖,。還原性糖在凍干過程中可以有效抑制蛋白結(jié)構(gòu)的去折疊,，但是在干燥樣品的儲(chǔ)存過程中，可以通過美拉德反應(yīng)（糖的羰基和蛋白質(zhì)上的游離氨基）降解蛋白,，結(jié)果形成含有降解蛋白的棕色糖漿,，而不是含活性蛋白的白色蛋糕狀結(jié)構(gòu)。通常,，我們減緩這個(gè)過程的方法是將樣品儲(chǔ)存在零度以下,，這就失去了產(chǎn)品凍干的意義，這些還原性的糖包括：葡萄糖,，乳糖,，麥芽糖，麥芽糊精等,。

在早期的研究中,，晶體類的填充劑如甘露醇，甘氨酸在凍干過程中不能提供蛋白很好的穩(wěn)定性,，但是,，一些配方使用了這兩種物質(zhì)的混合物，并且成功地推向了市場(chǎng),。在這些案例中,，甘露醇和甘氨酸適當(dāng)?shù)谋壤梢詫?dǎo)致一大部分的化合物保持無定形狀態(tài)。這部分無定形狀態(tài)的化合物足以抑制凍干過程中蛋白的去折疊并且提供長(zhǎng)期儲(chǔ)存的穩(wěn)定性,。但是建議謹(jǐn)慎選擇這種方法,，因?yàn)檫_(dá)到合適的工藝條件再加上合適的賦形劑比例，既耗時(shí)又很難辦到的,。

03賦形劑的合理選擇

如何合理的選擇賦形劑,？

案例分享

舉個(gè)具體的案例說明,，假設(shè)：

1. 蛋白藥物的濃度定在2mg/ml；

2. 主要的降解途徑是凍干后或復(fù)水后蛋白的聚合以及儲(chǔ)存期間蛋白的脫氨基,；

3. 優(yōu)化具體的條件（如用檸檬酸鹽緩沖液控制pH為6）只能將凍干和復(fù)水后聚合程度降到10%,，盡管樣品在低于Tg溫度的20℃下進(jìn)行儲(chǔ)存脫氨基速度仍然不能接受,。加入晶體類的膨脹劑,，如甘露醇，保持樣品強(qiáng)壯的結(jié)構(gòu)及良好的外觀,。

在這種情況下,，主要缺少的成分是非還原性雙糖，其在干燥樣品中會(huì)與蛋白形成無定形的結(jié)構(gòu),，作為主要的穩(wěn)定劑,，主要選擇蔗糖或海藻糖。它們?cè)陬A(yù)凍階段能夠很有效地保護(hù)蛋白并且能夠很好的抑制復(fù)水過程中蛋白結(jié)構(gòu)的去折疊,。預(yù)凍階段的保護(hù)取決于初始糖的總濃度,，有時(shí)，超過5%（w/t）的濃度可以盡可能大程度地保持蛋白的穩(wěn)定性,。相反,，在干燥階段，蛋白的保護(hù)取決于Final糖和蛋白的質(zhì)量比,。一般來說,，糖和蛋白的重量比至少為1:1時(shí)，可以提供較好的穩(wěn)定性,，當(dāng)達(dá)到5:1時(shí),，可以達(dá)到很佳的穩(wěn)定性。保持蛋白的濃度不變,，選取一定范圍的糖濃度進(jìn)行篩選和檢測(cè),，通過干燥樣品中天然結(jié)構(gòu)保留率以及復(fù)水后蛋白聚合降低的程度來確定最合適的濃度。

一般來說,，合適的糖濃度,，可以在凍干過程中提供蛋白很好的穩(wěn)定性，并且如果Final樣品的Tg高于儲(chǔ)存溫度,，在后期的儲(chǔ)存期間也可以提供蛋白較好的穩(wěn)定性,。例如，假定最高的儲(chǔ)存溫度為30℃,，那么Final產(chǎn)品的Tg ＞50℃應(yīng)該是穩(wěn)定的,，但前提是Final樣品的含水量需要達(dá)到允許的水平，因?yàn)樗值拇嬖跁?huì)降低樣品的Tg,?？梢允褂?/span>DSC檢測(cè)每種樣品的Tg值,。

蔗糖/海藻糖如何選擇？

蔗糖和海藻糖,，作為兩種常用的穩(wěn)定劑,，均有其優(yōu)勢(shì)和劣勢(shì)，可根據(jù)不同的情況進(jìn)行選擇：

● 在任何水分含量的樣品中,，海藻糖均會(huì)有較高的Tg,，因此較為容易凍干。另外Tg ＞50℃的條件可以允許樣品有較高的殘留水分,。然而,，技術(shù)工程師應(yīng)該能夠針對(duì)這兩種雙糖設(shè)計(jì)經(jīng)濟(jì)有效的工藝。如果樣品中蛋白濃度較高,，可以提高Tg,，這樣就會(huì)弱化海藻糖的作用；

● 與蔗糖相比,，海藻糖更能抵抗酸解,，雙糖水解后會(huì)產(chǎn)生還原性的單糖，這是需要避免的,。通常情況下,，如果pH不是很低，如pH4左右或更低,，這個(gè)應(yīng)該不是很大的問題,；

● 蔗糖在凍干過程中抑制蛋白去折疊方面看似比海藻糖更有優(yōu)勢(shì)，當(dāng)?shù)鞍自陬A(yù)凍階段非常不穩(wěn)定（需要較高的糖濃度）和/或蛋白濃度較高時(shí),，這種優(yōu)勢(shì)更明顯,。海藻糖的相對(duì)不穩(wěn)定性是由于在預(yù)凍和干燥過程中其更易于與蛋白之間產(chǎn)生相分離。對(duì)于給定的配方,，這是否會(huì)有問題不能被預(yù)測(cè),，因此，每種制劑配方都需要檢查其保護(hù)蛋白的能力,。

表面活性劑的作用

在這里,，我們案例中的配方可能就比較完整了，就像許多蛋白質(zhì)的情況一樣,。然而,，我們假設(shè)，即使蔗糖全部抑制可檢測(cè)的蛋白質(zhì)去折疊,，正如用紅外光譜對(duì)干燥固體的結(jié)構(gòu)分析所評(píng)估那樣,，在復(fù)水后，仍然有1%的聚合蛋白。因?yàn)樵谠嫉臉悠分惺菦]有任何聚合的,，假設(shè)在凍干過程中,，一小部分蛋白發(fā)生了去折疊，在復(fù)水后,，部分這些分子又重新折疊,，但是部分聚合在一起。這個(gè)實(shí)際上看起來是個(gè)很普遍的問題,，就像在凍干之前一些處理造成的聚合,。幸運(yùn)的是，通過在配方中加入一些非離子型表面活性劑,，如聚山梨醇酯（吐溫）通?？梢砸种频鞍椎木酆?。要求的濃度通常比較低（＜0.5% w/v）,，通過將表面活性劑滴定到包含所有其它組分的凍干制劑中，可以識(shí)別出理想濃度,。應(yīng)避免加入過量,，因?yàn)楸砻婊钚詣┰谑覝叵率且后w的狀態(tài)，如果濃度較高,，會(huì)降低配方的玻璃態(tài)轉(zhuǎn)變溫度,。然而，通常在優(yōu)化蛋白質(zhì)穩(wěn)定性所需的非常低的濃度下,，不會(huì)有問題,。

表面活性劑看作是畫龍點(diǎn)睛，通常在凍干產(chǎn)品配方中加入表面活性劑是有利的,，可以抑制處理過程中界面引起的去折疊和聚集（如起泡夾帶或瓶-液界面引起的）,。

最重要的是表面活性劑在凍干/復(fù)水過程中抑制聚合的能力，目前還不太清楚表面活性劑的保護(hù)在哪一步起作用的,。有資料證明,，表面活性劑在凍融及復(fù)水過程中可減少蛋白聚合并且在預(yù)凍階段有助于抑制蛋白的去折疊，對(duì)干燥固體中聚集物特定紅外波段的檢查表明,，表面活性劑可以抑制凍干過程中產(chǎn)生的聚集,。在復(fù)水過程中，曲折疊分子的聚合能通過表面活性劑得到抑制,，猜測(cè)是通過分子之間的相互作用和/或作為一種潤(rùn)濕劑,，加速凍干產(chǎn)品的溶解。如果顯示表面活性劑在復(fù)水過程中是有益的,，則可以通過在稀釋劑中加入表面活性劑來達(dá)到這種效果,。

》》》還有哪些意想不到的危險(xiǎn)可能會(huì)導(dǎo)致失敗,？

盡管根據(jù)上述給出的建議,，對(duì)于給定蛋白,，我們可以設(shè)計(jì)出成功的配方，但是,，還有其他一些問題可能會(huì)導(dǎo)致Final失敗,，特別是在長(zhǎng)期儲(chǔ)存期間。

● 賦形劑中經(jīng)常會(huì)有一些污染物,，這些會(huì)導(dǎo)致蛋白快速的化學(xué)降解,，糖類和甘露醇中會(huì)含有過渡金屬元素，表面活性劑可能被過氧化物污染,，所有的這些可以促進(jìn)蛋白的氧化,；

● 在儲(chǔ)存過程中，水分從膠塞轉(zhuǎn)移到產(chǎn)品,，引起水分參與的降解,，直接損壞蛋白，并且降低蛋白的Tg,加速蛋白的降解,，特別是當(dāng)儲(chǔ)存溫度高于Tg 時(shí),；

● 即使在高溫（如40℃）下的儲(chǔ)存穩(wěn)定性研究中，一切都表現(xiàn)出理想的狀態(tài),，但有一個(gè)常見的,，但很少報(bào)道的事件可能是災(zāi)難性的，這個(gè)問題可以用下面的故事來說明,。產(chǎn)品在實(shí)驗(yàn)室中在40℃下儲(chǔ)存可以保持幾個(gè)月的穩(wěn)定性,，在冬季，產(chǎn)品在運(yùn)輸過程中也保持良好的穩(wěn)定性,，沒有來自消費(fèi)者的問題報(bào)告,，然而，有時(shí)在夏季,，運(yùn)輸后,，在室溫下儲(chǔ)存僅2周后發(fā)現(xiàn)產(chǎn)品過度降解，用差示掃描量熱儀DSC對(duì)一開始的干燥粉末進(jìn)行了檢查,，給出了合理的解釋,，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，制劑中的甘露醇沒有全部結(jié)晶,，而是形成了Tg約為45℃的亞穩(wěn)玻璃態(tài),，當(dāng)在夏季運(yùn)輸過程中，超過了這個(gè)溫度時(shí),，甘露醇變發(fā)生結(jié)晶,，最先與甘露醇結(jié)合的水被轉(zhuǎn)移到了剩余的無定形相中，蛋白相的水含量增加，降低了它的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度,，因此,，加速了蛋白質(zhì)的降解。這個(gè)問題可以使用DSC設(shè)計(jì)合理的退火方案使甘露醇再預(yù)凍階段全部結(jié)晶來避免,，另外也可以通過調(diào)整甘露醇的濃度,，降低殘留水分含量，使甘露醇即使在45℃的條件下也不會(huì)結(jié)晶,。

》》》對(duì)于給定的蛋白藥物,，這些信息足夠嗎？

對(duì)于大多數(shù)的蛋白,，上面給出的建議一般會(huì)設(shè)計(jì)出成功的配方,，但是，每種蛋白都有其自有的的物理化學(xué)特性和穩(wěn)定性要求,。因此,，針對(duì)每種不同的蛋白，配方也需要自定義設(shè)計(jì),。結(jié)合蛋白本身的特性知識(shí)以及選擇合理的賦形劑可以快速設(shè)計(jì)出穩(wěn)定的凍干蛋白配方,。

最后,，在快速凍干工藝中保持干物質(zhì)的物理性質(zhì)和在干燥后獲得天然的蛋白質(zhì)之間需要折衷,，研究表明：當(dāng)蔗糖結(jié)合葡聚糖一起使用時(shí)，由于蔗糖的作用,，蛋白質(zhì)的天然結(jié)構(gòu)可以保留在干燥的固體中,；葡聚糖的存在提高了制劑的Tg，并提供了一種無定形的填充劑,，快速干燥的同時(shí)保留了所需的蛋糕性質(zhì),；其他的一些聚合物有可能提供與葡聚糖相同的優(yōu)勢(shì)，如氨基乙基乙醇胺淀粉也具有較高的Tg,，通常比葡聚糖更容易接受用于腸胃外給藥,。期望可以合理地利用這些多聚物作為Tg的調(diào)節(jié)劑，使得制劑更穩(wěn)定,，更容易快速凍干,。

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譯自：《Rational Design of Stable Lyophilized Protein Formulations:Some Practical Advice》  John F.Carpenter,Michael J.Pikal,Byeong S.Chang,Theodore W.RandolpH pHarmaceutical Research, Vol.14,No.8,1997

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