大腸桿菌（E.coli）重組蛋白表達(dá)技術(shù)經(jīng)過多年的發(fā)展，相對于其他表達(dá)體系,，算是非常成熟的一個(gè)體系,。大腸桿菌蛋白表達(dá)系統(tǒng)主要有以下特點(diǎn)：遺傳背景清楚；易于培養(yǎng)和控制,；轉(zhuǎn)化操作簡單,；表達(dá)水平高；成本低,；周期短,。本篇將對大腸桿菌重組蛋白表達(dá)系統(tǒng)的常見技術(shù)問題進(jìn)行一一解答,。

1、大腸桿菌表達(dá)體系的優(yōu)點(diǎn)是什么,？

（1）菌體繁殖速度快：20分鐘倍增一次,，這意味著按照1/100的比例接種（MOI），只需要幾個(gè)小時(shí)培養(yǎng)基細(xì)菌即可到達(dá)穩(wěn)定期,；

（2）容易實(shí)現(xiàn)高密度培養(yǎng)：理論培養(yǎng)密度是1 × 1013 cells/ml,，實(shí)際培養(yǎng)過程中使用LB培養(yǎng)基在37℃培養(yǎng)大腸桿菌，<1 × 1010 cells/ml,。在低溫（11℃）誘導(dǎo)蛋白表達(dá)時(shí),，細(xì)菌個(gè)數(shù)幾乎不增長。

（3）轉(zhuǎn)染外源DNA容易,，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率高,。

2、選擇什么樣的質(zhì)粒體系,？

目前最為常用的重組蛋白表達(dá)質(zhì)粒載體融合了復(fù)制子(Replicon),、啟動子(promoter)、篩選標(biāo)簽(selection marker),、多克隆位點(diǎn)（MCS）和融合蛋白移出策略(fusion tag removal strategy),。

復(fù)制子：包含復(fù)制起始點(diǎn)及相關(guān)順式作用控制元件（cis-acting control elements）。在選擇合適的質(zhì)粒載體時(shí),，質(zhì)?？截悢?shù)應(yīng)當(dāng)是需要考慮的一個(gè)重要參數(shù)。幾個(gè)常用的載體系列,，如pET,、pUC、pACYC ,、pBAD和pSC101,。pET系列載體含有pMB1起始子，在單個(gè)菌體中通常含有15-60 copies,，通過改造pET載體,，可以獲得雙表達(dá)質(zhì)粒（BiPlasmid vector），該質(zhì)粒含有雙MCS位點(diǎn),，雙T7啟動子,，雙lac操縱子和雙核糖體結(jié)合位點(diǎn)；pUC系列含有一個(gè)突變版本的pMB1起始子,，在該系列的載體在單個(gè)細(xì)菌通常有500–700 copies,；pACYC和pBAD系列常被用于雙表達(dá)體系，如FRET系統(tǒng),，該系列含有p15A起始子,，單個(gè)細(xì)胞含有10-12個(gè)copies,；pSC101系列載體單個(gè)細(xì)胞中的拷貝數(shù)通常<5個(gè)，常被用于三種蛋白的共表達(dá),。

啟動子：重組蛋白大腸桿菌表達(dá)體系中,，lac啟動子是最為常用的啟動子之一。當(dāng)培養(yǎng)基中只存在乳糖（lactose）作為wei一碳源時(shí),，lac啟動子被激活,，開始重組蛋白表達(dá)。常用帶T7啟動系統(tǒng)的pET系列載體表達(dá)目的蛋白,，當(dāng)含有T7啟動系統(tǒng)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)菌后,，挑取單克隆，培養(yǎng)并加入IPTG（異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷,，一種非水解性的乳糖類似物）誘導(dǎo)細(xì)菌表達(dá)重組蛋白,。為了消除重組蛋白本底表達(dá)，可以在原先的pET系列質(zhì)粒載體基礎(chǔ)上加入T7溶酶體與T7 RNAP（RNA polymerase）共表達(dá),，T7溶酶體能夠結(jié)合T7 RNA聚合酶并限制T7啟動子介導(dǎo)的起始轉(zhuǎn)錄,。

親和標(biāo)簽：重組蛋白表達(dá)過程中采用親和標(biāo)簽一方面是為了使蛋白純化過程更加容易；另一方面是為了促進(jìn)某些不溶性蛋白可溶,。蛋白標(biāo)簽可分兩類：一類是短肽類標(biāo)簽,；一類是長肽以融合蛋白（fused partner）形式共表達(dá)。長肽類標(biāo)簽更多的作用是促進(jìn)蛋白可溶性,，往往需要同時(shí)加入短肽標(biāo)簽以幫助蛋白純化,；短肽類標(biāo)簽一般只含幾個(gè)氨基酸，分子量均<2 kDa,，對重組蛋白的性質(zhì)影響較小,。親和標(biāo)簽可以放置在蛋白的C-端和N-端,，如需要表達(dá)分泌性蛋白,，則放置于C-端，信號肽放置于N-端,。不同的蛋白標(biāo)簽需要根據(jù)具體需求進(jìn)行選擇,。

3、去除蛋白標(biāo)簽的方法有哪些,？

去除蛋白標(biāo)簽的方法分為兩類,，一類是酶消化法；一類是化學(xué)裂解法,?；瘜W(xué)裂解法通常被用于融合伴侶蛋白的移除，如CNBr用于裂解與Met氨基酸C-端連接的多肽,，該方法優(yōu)點(diǎn)是價(jià)格便宜,，缺點(diǎn)是蛋白序列中不能存在Met氨基酸殘基,。酶消化法是目前最為常用的蛋白標(biāo)簽去除方法，如腸激脢（Enterokinase）,，凝血酶（thrombin）,，factor Xa和煙草蝕刻病毒蛋白酶 (TEV protease)等移除蛋白標(biāo)簽，只殘留少數(shù)幾個(gè)氨基酸殘基,。帶有His標(biāo)簽的TEV蛋白酶逐漸被廣泛接受用于蛋白標(biāo)簽移除實(shí)驗(yàn),，該蛋白酶具有一個(gè)非常優(yōu)秀的特點(diǎn):切除標(biāo)簽后，只殘留一個(gè)Ser或Gly殘基或wan全不殘留氨基酸殘基,。

4,、什么是合適的蛋白表達(dá)宿主？

重組蛋白原核表達(dá)常采用BL21（DE3）和K-12衍生菌株作為表達(dá)宿主,。BL21菌株缺乏Lon蛋白酶和外膜蛋白酶OmpT,，Lon蛋白酶主要功能是降解外源蛋白，外膜蛋白酶OmpT主要功能是降解胞外基質(zhì)蛋白,。同時(shí)BL21菌株具有先天性的hsdSB基因突變,，菌株失去甲基化和降解外源轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的能力，使得質(zhì)粒能夠傳代保留至子代細(xì)菌中（hsdSB突變基因來源于父輩B834菌株）,。K-12系列菌株具有兩大優(yōu)點(diǎn)：一個(gè)是能夠促進(jìn)胞質(zhì)中蛋白二硫鍵的形成,，主要原因是trxB（thioredoxin reductase）基因發(fā)生突變；另外一個(gè)是recA基因突變,，改基因突變后外源質(zhì)粒在宿主菌種中得以穩(wěn)定存在,。

5、大腸桿菌表達(dá)體系為什么會出現(xiàn)無或低蛋白表達(dá)的結(jié)果,？

誘導(dǎo)前后蛋白存在毒性或者表達(dá)過程中密碼子有偏向性,，都可能造成蛋白不表達(dá)或低表達(dá)的結(jié)果。建議從以下幾個(gè)方面來解決問題：

1）控制本底表達(dá)水平：基于lac-based啟動子表達(dá),，加入葡萄糖,；選擇以葡萄糖為碳源培養(yǎng)基；基于T7-based啟動子表達(dá),，使用含有T7溶酶體質(zhì)粒,；使用嚴(yán)謹(jǐn)控制型質(zhì)粒，降低拷貝數(shù),。

2）控制誘導(dǎo)表達(dá)水平：采用可調(diào)節(jié)啟動子,；采用可控制誘導(dǎo)菌株；降低拷貝數(shù),；采用適用毒性蛋白表達(dá)菌株,；采取分泌性表達(dá)策略。

3）優(yōu)化質(zhì)粒DNA密碼子,，以適應(yīng)宿主密碼子體系使用密碼子調(diào)整菌株,。

4）增加生物質(zhì)：嘗試新培養(yǎng)基,；改善通氣條件，避免泡沐,。

6,、為什么會形成包涵體？

重組蛋白體系表達(dá)過程中,，形成不正確的二硫鍵,、進(jìn)行錯(cuò)誤的折疊、產(chǎn)生低可溶性蛋白,，以及缺少翻譯后修飾這一重要環(huán)節(jié),，都可能形成包涵體?？梢圆扇∫韵虏呗詠斫鉀Q這些問題,。

1）使用胞質(zhì)具有氧化功能的E. coli進(jìn)行分泌性表達(dá)。

2）共表達(dá)分子伴侶,。

3）補(bǔ)充含有化合物伴侶和共因子的培養(yǎng)基,。

4）移除誘導(dǎo)劑，增加新鮮培養(yǎng)基,。

5）通過低溫誘導(dǎo)表達(dá)或調(diào)整誘導(dǎo)劑濃度來降低表達(dá)速率,。

6）改變?nèi)诤习閭H蛋白，促進(jìn)可溶蛋白表達(dá),。

7）改變表達(dá)宿主,，如原核改變成真核表達(dá)系統(tǒng)。