1.介紹

利用攪拌式生物反應(yīng)器(STR)在哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)中產(chǎn)生許多治療性蛋白質(zhì)(例如,，單抗,、融合蛋白,、酶)。生物反應(yīng)器提供了對最佳細(xì)胞生長和蛋白質(zhì)生產(chǎn)的關(guān)鍵參數(shù)的控制,，如溫度,、溶解氧(DO)和pH。根據(jù)產(chǎn)品和工藝的特點，重組蛋白的生產(chǎn)有多種細(xì)胞培養(yǎng)方法,，包括分批,、重復(fù)分批、補(bǔ)料分批和灌流,。還使用了系列細(xì)胞類型(如CHO,、NS0、BHK,、PER.C6),。其中CHO是廣泛使用的。在小規(guī)模生物反應(yīng)器中開發(fā)制造工藝,，然后擴(kuò)大到所需的大規(guī)模生產(chǎn)制造規(guī)模,。生產(chǎn)規(guī)模由市場需求和工藝經(jīng)濟(jì)決定。目前,，高達(dá)10,000-25,000L的大型生物反應(yīng)器通常用于基于哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)的生物制劑生產(chǎn),。由于所需的流體動力學(xué)條件和培養(yǎng)需求的差異,，細(xì)胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器與微生物生物反應(yīng)器的設(shè)計和放大可能有很大不同,。

在過去的幾十年里，對生物反應(yīng)器放大的了解一直在穩(wěn)步增加,，但大型生物反應(yīng)器由于其在混合和傳質(zhì)方面的局限性,，本質(zhì)上更難操作。隨著生物反應(yīng)器規(guī)模的增加,，混合時間的增加,，都是生物反應(yīng)器操作和規(guī)模平移中的一個挑戰(zhàn)。此外,，細(xì)胞,、培養(yǎng)基和工藝的改進(jìn)將細(xì)胞密度推到了更高的水平，從而對擴(kuò)大規(guī)模提出了新的挑戰(zhàn),。

近年來,，一次性生物反應(yīng)器在國內(nèi)外得到廣泛應(yīng)用，一次性生物反應(yīng)器已迅速應(yīng)用于臨床生產(chǎn),，并正在進(jìn)入商業(yè)生產(chǎn),。艾貝泰生物科技有限公司現(xiàn)提供多種型號的一次性生物反應(yīng)器。反應(yīng)器中空袋主要由塑料制成,，設(shè)計為一次性使用,，從而消除了不銹鋼(SS)設(shè)計的原位清洗(CIP)和原位滅菌(SIP)方面的問題。一次性生物反應(yīng)器的使用是由改進(jìn)的細(xì)胞培養(yǎng)過程和設(shè)施經(jīng)濟(jì)帶來的產(chǎn)品高濃度驅(qū)動的,。放大方法和操作與不銹鋼生物反應(yīng)器有很大的相似之處,。但是具有操作問題，例如袋壓和混合，討論了這些方面對放大的影響,。

2.工程參數(shù)

表1列出了哺乳動物培養(yǎng)中通常認(rèn)為的工程參數(shù),，隨后詳細(xì)描述了不同的參數(shù)。一些參數(shù),，如單位體積功率輸入(P/V)和流量數(shù)(F1)取決于流型,，并給出了假設(shè)湍流的表達(dá)式。表中還顯示了不同參數(shù)之間的相互依賴關(guān)系,。

表1—使用不同標(biāo)準(zhǔn)從3L生物反應(yīng)器放大到20,000L生物反應(yīng)器,。

原文提供了詳細(xì)的工程參數(shù)計算方式和含義的說明，本文不進(jìn)行贅述,。

2.1氣體傳輸

（1）O₂供應(yīng):細(xì)胞培養(yǎng)上清液與空氣平衡時的氧氣濃度約為0.19 mM,。細(xì)胞比氧攝取率(qO2)為4 pmol/cell/day，細(xì)胞密度為10?/ml的培養(yǎng)物在幾分鐘內(nèi)就會消耗掉氧氣,。因此,，必須不斷地向培養(yǎng)物供應(yīng)氧氣。使用空氣或氧氣時,，氧氣的體積傳質(zhì)系數(shù)Kla(由氧氣傳遞率(OTR定義)需要約為2h^-1?才能支持該培養(yǎng),。

圖1細(xì)胞比氧攝取率(qO2)在1-10 pmol/cell/day范圍內(nèi)的哺乳動物細(xì)胞的估計Kla需要量。

（2）CO₂供應(yīng): 通過逸度(pCO₂)來描述的溶解CO₂水平的控制,，在細(xì)胞培養(yǎng)過程中與碳酸氫鹽(HCO)的解離平衡中也是至關(guān)重要的,。高溶解CO₂水平會抑制細(xì)胞生長，產(chǎn)生代謝壓力,，甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡,，影響培養(yǎng)效率和產(chǎn)品質(zhì)量。低溶解CO₂水平也可以減緩生長和影響性能,，因為HCO₃^-介導(dǎo)了一些細(xì)胞過程,，如戊糖磷酸途徑和補(bǔ)充復(fù)變中間體。培養(yǎng)物中的細(xì)胞也通過兩種機(jī)制影響溶解的CO₂水平,。第一種是細(xì)胞的有氧呼吸,，呼吸商RQ=CER/OUR約為0.8至1。第二個經(jīng)常被忽視的是培養(yǎng)物產(chǎn)生的酸,，主要是乳酸,，它通過以下反應(yīng)與培養(yǎng)物中的重碳酸鹽反應(yīng)：

在許多培養(yǎng)開始時，當(dāng)細(xì)胞密度低,，乳酸產(chǎn)量高時,，這種機(jī)制產(chǎn)生的二氧化碳可以超過有氧呼吸產(chǎn)生的CO₂。該反應(yīng)還將HCO₃^-轉(zhuǎn)化為CO₂?,，對pH的影響比單獨產(chǎn)生二氧化碳的影響更大,。為了保持恒定的pH值，要么必須添加堿，要么需要非常有效地去除CO₂,。

（3）氣體傳遞技術(shù)和氣體傳遞系數(shù)的確定: 細(xì)胞培養(yǎng)常用的兩種技術(shù)是小型生物反應(yīng)器的表面轉(zhuǎn)移和用于大型生物反應(yīng)器的直接通氣,。

O₂的氣體傳遞系數(shù)Kla通常是通過經(jīng)典的瞬時放氣方法測量的，即用N₂降低DO水平,，然后用空氣或氧氣來提高DO水平,。在N₂剝離和Air/O₂通氣過程中，都可以使用與氣體平衡的適當(dāng)O₂濃度,；N₂為0,，Air為0.19 mM，O₂為0.9 mM,，來估算Kla,。為了計算Kla，假定氣體和液體和塞狀流是混合的,。在細(xì)胞存在的情況下,，通過停止Air或O₂通入并允許DO下降到較低水平來測量它。

CO₂?氣體傳遞系數(shù)kla,，由于CO2?的高溶解度,，氣體在生物反應(yīng)器中上升時會與介質(zhì)中的CO_2?平衡。CO₂?的實際去除取決于通氣中CO_2?的平衡程度,。

從實驗室規(guī)模的生物反應(yīng)器到中試和大型的生物反應(yīng)器的放大會導(dǎo)致氣體轉(zhuǎn)移過程中的損失,。這會隨著規(guī)模的擴(kuò)大而影響培養(yǎng)物的O₂和CO₂水平。假設(shè)培養(yǎng)物消耗或生產(chǎn)相同,，對于較大的生物反應(yīng)器，除了低密度的培養(yǎng)物外,，表面氣體對O₂的轉(zhuǎn)移是不夠的,。對于CO₂，在從實驗室規(guī)模擴(kuò)大的過程中,，CO₂表面去除的損失是造成CO₂積累的主要因素,。Air通常在放大中對Sparger設(shè)計的更改以彌補(bǔ)損失。

2.2攪拌

攪拌最常見的放大標(biāo)準(zhǔn)是P/V如前所述,。按比例放大會導(dǎo)致P/V隨著V^5/3的增加而增加,，這涉及到使用比在實驗規(guī)模下使用的高徑比更高的容器，也就是說,，在可用的設(shè)備下,，尺寸上的相似性通常是不可行的。如果不使用多個葉輪,，這對混合時間有負(fù)面影響,。超過1:1的H:T(生物反應(yīng)器高度:生物反應(yīng)器直徑)比，對t_m∝(H/T)^2.5有很強(qiáng)的依賴性。使用多個葉輪時,，可以從單獨的混合區(qū)進(jìn)行較慢的混合,。P/V與混合時間有關(guān)，因此代表均勻化速率,。P/V 也與平均P/V相關(guān),，因此代表了潛在的水動力損傷。它是一個比例如葉尖速度更合適的比例放大,。特別是按葉頂速度放大會導(dǎo)致混合時間過差,。雖然P/V是一個很好的放大標(biāo)準(zhǔn)，但也具有一定的風(fēng)險,。

3.放大過程中葡萄糖代謝溢出

雖然在哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)放大過程中很少觀察到葡萄糖代謝溢出,，但有注意到葡萄糖/乳酸代謝隨規(guī)模的增加而變化的情況，在擴(kuò)大規(guī)模期間觀察到葡萄糖消耗和乳酸生成率的增加,。雖然葡萄糖代謝溢出的原因可能有所不同,，可以肯定的是，葡萄糖代謝效率低下與培養(yǎng)性能受損有關(guān),。葡萄糖和乳酸代謝的這種變化導(dǎo)致額外的堿添加和滲透壓增加,，這兩者都可能對工藝性能產(chǎn)生負(fù)面影響。

4.高密度培養(yǎng)

隨著高灌流率和中空纖維過濾裝置的應(yīng)用,，在灌注培養(yǎng)中可以達(dá)到非常高的密度,，達(dá)到 50 ~ 100 × 10^{^6}cells/mL，甚至更高,。例如,，使用切向流過濾系統(tǒng)可達(dá)到 214 × 10^{^6}cells/mL的 CHO 細(xì)胞密度，使用交替切向流系統(tǒng)可達(dá)到 132×10^{^6}cells/ mL,。細(xì)胞密度增大的同時,，粘度也會增大，可能在影響工藝性能,。

5.規(guī)?；囊淮涡陨锓磻?yīng)器設(shè)計

大多數(shù)一次性生物反應(yīng)器的設(shè)計方式類似于標(biāo)準(zhǔn)的圓柱形SS攪拌生物反應(yīng)器。葉輪和電機(jī)的位置根據(jù)設(shè)計而有所不同,，其中使用頂部或底部安裝的電機(jī),。攪拌是由預(yù)先安裝的葉輪提供的，這些葉輪附著在頂部或通過支撐基座,。生物反應(yīng)器內(nèi)的 pH,、DO、溫度等監(jiān)測采用與傳統(tǒng) SS 罐類似的探針和技術(shù),。除了圓柱形攪拌槽外,，還開發(fā)了采用不同幾何形狀和/或攪拌和混合機(jī)制的替代一次性生物反應(yīng)器系統(tǒng),。

放大一次性反應(yīng)器采用與不銹鋼生物反應(yīng)器類似的方法，例如,，P/V仍然是反應(yīng)器的推薦放大標(biāo)準(zhǔn),。反應(yīng)器中的細(xì)胞培養(yǎng)性能已被證明與使用類似放大標(biāo)準(zhǔn)的不銹鋼生物反應(yīng)器中的細(xì)胞培養(yǎng)性能相當(dāng)。

生物反應(yīng)器壓力:不銹鋼生物反應(yīng)器通常在正壓下運行;在SS系統(tǒng)中可以壓力增加,，但在一次性反應(yīng)系統(tǒng)中則不能,。相反，SUBs中的壓力被密切監(jiān)測,，以避免袋壓過壓(例如,，某些系統(tǒng)<1psi;當(dāng)壓力超過最大允許值時，系統(tǒng)關(guān)閉控制器,。

雙曝氣系統(tǒng):為了實現(xiàn)所需的氧氣傳遞和二氧化碳去除,，通常使用雙曝氣系統(tǒng)，包括毫米孔徑的通氣口(如鉆孔,，用于空氣/N₂)和微米孔徑的通氣口(如燒結(jié)口,，用于O₂/CO₂)。雖然雙通氣口也用于SS生物反應(yīng)器,，但毫米孔徑的分散器與顆粒分散器的組合在一次性反應(yīng)器中更為普遍,。

這些通氣口產(chǎn)生的氣泡直徑只有幾到幾十毫米;通常認(rèn)為，在正常的PF68濃度下,，它們對細(xì)胞健康的風(fēng)險很低,，甚至沒有風(fēng)險。由于這些生物反應(yīng)器一次性袋是定制的,，因此可以定制分散器設(shè)計以滿足特定的工藝需求,。

在使用時，生物反應(yīng)器PID控制回路的調(diào)整可能會更加復(fù)雜,。

6.一次性生物反應(yīng)器混合性能的改進(jìn)

在典型的放大標(biāo)準(zhǔn)下,，隨著生物反應(yīng)器規(guī)模的增加而增加，這將增加大型生物反應(yīng)器中添加pH值溶液時的pH非均質(zhì)性,。混合的改進(jìn)有望進(jìn)一步提高工藝性能,，因為混合不充分會導(dǎo)致局部pH梯度,，會對哺乳動物培養(yǎng)物的性能產(chǎn)生負(fù)面影響?？梢酝ㄟ^優(yōu)化葉輪配置,、生物反應(yīng)器長徑比和擋板設(shè)計來優(yōu)化。艾貝泰生物科技有限公司自研的一次性生物反應(yīng)器是立方體設(shè)計,，具有天然擋板,，增加了生物反應(yīng)器內(nèi)的湍流,，在使用過程中具有*的混合時間數(shù)據(jù)，在低攪拌轉(zhuǎn)速時,，混合時間改善明顯,，將對整體培養(yǎng)性能產(chǎn)生積極影響。同樣支持細(xì)胞生長和蛋白質(zhì)生產(chǎn),。由于具有諸如改善混合條件或降低剪切等額外好處,，其中一些設(shè)計可以很好地滿足特定的工藝需求。

7.總結(jié)

雖然細(xì)胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器放大方法在過去十年中已經(jīng)相對成熟,，但仍在尋求進(jìn)一步優(yōu)化的改進(jìn),。部分原因是由于生物反應(yīng)器設(shè)計的局限性，由于氣體傳輸和混合限制,，歷史設(shè)計可能不適合新工藝的采用,。使放大性能進(jìn)一步復(fù)雜化的是，許多“放大”挑戰(zhàn)是由不同規(guī)模的生物反應(yīng)器設(shè)計差異驅(qū)動的,。盡管有各種各樣的分散器和葉輪設(shè)計可供選擇,，但改造現(xiàn)有設(shè)施以適應(yīng)不同的工藝/產(chǎn)品開發(fā)環(huán)境并非易事。放大性能受損通常是由于設(shè)備的差異和限制,。

作為一次性應(yīng)用系統(tǒng)中極為重要的產(chǎn)品體系,，隨著國內(nèi)生物制藥行業(yè)近年來的高速發(fā)展，越來越多的用戶開始關(guān)注擁有更強(qiáng)功能性,、更高效性和易用安全的一次性生物反應(yīng)器,。針對研發(fā)、臨床前,、臨床階段以及生產(chǎn)階段的商業(yè)化項目,，一次性反應(yīng)器都具有優(yōu)勢。艾貝泰作為國內(nèi)始終致力于生物制藥行業(yè)工藝解決方案的理想供應(yīng)商,。