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iPSC單克隆案例分享丨MG基質(zhì)膠,、CEPT提高iPSC單克隆效率

來源：廣州市艾貝泰生物科技有限公司 2023年05月22日 14:32

誘導多能干細胞（induced pluripotent stem cells,，iPSC）是指通過人工對體細胞進行重編程,，逆分化培養(yǎng)出的一類具有類似人胚干細胞特征的多能干細胞,。它們具有體外培養(yǎng)無限增殖,、自我更新的能力以及巨大的分化潛能,，在藥物發(fā)現(xiàn),、合成生物學和細胞治療等方面具有巨大的前景,。隨著iPSC應用的增多，勢必有越來越多的需求去建立標準化的單克隆iPSC主細胞庫（MCB），用于后續(xù)的可持續(xù)供應且穩(wěn)定的生產(chǎn)工藝流程中,。

材料與方法

Cytena單細胞打印機通過噴墨式打印技術,，溫和的將單個細胞自動分離到標準的96或384孔板中，分選過程中,，高分辨率的光學系統(tǒng)可根據(jù)細胞直徑,、圓度或熒光強度分選出需要的單細胞，且提供單細胞來源的圖像證據(jù),，有助于通過監(jiān)管機構(gòu)的審核,。

為了提高單細胞分選效率，比較不同重懸體系對分選過程的影響,；為了提高克隆效率,，對不同基質(zhì)膠對克隆效率的影響進行了比較；比較了用Y-27632或CEPT處理后的克隆效率,；通過核型分析,，判斷CEPT的處理是否會引起遺傳異常。

01 CEPT四組分混合物的確定

通過超低細胞密度的高通量篩選確定四因子混合物CEPT：Chroman 1 (ROCK 抑制劑), Emricasan (半胱天冬酶抑制劑),，Polyamines（多胺）和Trans-ISRIB（綜合應激反應抑制劑）,。其用于改善細胞存活、細胞附著和蛋白質(zhì)翻譯,。

02樣品準備

iPSC細胞：細胞培養(yǎng)4/5天時,，達到60%匯合度，使用TrypLE select消化細胞,，使用 20-40 μm 過濾器（清除懸浮液中可能阻礙芯片的團塊）,，最后重懸于HBSS/E8 medium/DMEM/StemFlex+ Rock抑制劑中，濃度為0.5x10⁶ cells/mL,。

03單細胞分選

使用Cytena單細胞打印機可直接捕獲噴嘴圖像作為嚴格單細胞分選證據(jù),。流式分選作為對照組。

04克隆增殖

選擇八個利用CEPT產(chǎn)生的克隆并建立克隆細胞系,。

05核型分析

四次傳代后,，對八個選擇的克隆細胞系進行核型分析

結(jié)果

使用mTeSR/E8 + Rock抑制劑分別對樣品進行重懸，濃度為0.5x 10⁶cells/mL進行上機分選都有不錯的表現(xiàn),。在同一iPSC細胞中,，對比了LN521和LN521+E-Cad的差異，發(fā)現(xiàn)E-cad的存在對單克隆率沒有提升效果,，單克隆率反而降低,。MG基質(zhì)膠能很顯著的提升iPSC細胞單克隆率，在LN521基質(zhì)膠中,，單克隆不到1%，但是MG基質(zhì)膠中卻有38%的單克隆率,。在第三個iPSC細胞中,，用添加了RevitaCell的mTeSR1重懸細胞,，然后分選單細胞在MG基質(zhì)膠的孔板中，獲得了68%的單克隆率,。

圖1：使用不同重懸培養(yǎng)基以及不同基質(zhì)膠處理后的單克隆率表（MG: Matrigel; LN521: Laminin 521; E-Cad: E-Cadherin）

Cytena 單細胞打印機分選過程中能留下多張噴嘴圖片,，在噴嘴的ROI檢測識別區(qū)域，軟件能識別細胞的直徑,、圓度等參數(shù),，確認細胞的“良好狀態(tài)”，符合要求的“強壯的”單細胞到孔板里,，不符合要求的細胞則被真空吸走,。噴嘴圖片證實單細胞來源，單細胞鋪板效率＞95%,。

圖2：單細胞率^[1]

Yu Chen^[2]等發(fā)現(xiàn),，相比于Y-2762,CEPT能顯著提升iPSC的單細胞過程中的存活率，相同小分子處理下,，用Cytena單細胞打印機分選iPSC細胞,，一塊96孔板獲得68個iPSC單克隆孔，比流式細胞儀分選高出~20%,。


圖3：克隆恢復率	圖4：CEPT可提高單克隆率

隨機選擇八個利用CEPT產(chǎn)生的克隆建立克隆細胞系,，四次傳代后，所有克隆細胞系（8/8）均為核型正常,，表明CEPT不會引起遺傳異常,。

圖5：CEPT未引起遺傳異常

圖6：Cytena 單細胞打印機用于iPSC基因修飾后的CLD

討論

iPSC對培養(yǎng)環(huán)境的變化十分敏感，如pH值,、滲透壓,、營養(yǎng)供應、機械應力/剪切力等,。在傳統(tǒng)的培養(yǎng)條件下,，iPSC通常在涂有各種細胞外基質(zhì)表面上密集生長。在對iPSC基因組編輯過程中,，最大的挑戰(zhàn)之一是獲得陽性單克隆細胞,。單個iPSC的生長過程中，減少了細胞和細胞之間,、細胞與細胞外基質(zhì)的接觸,，容易誘發(fā)細胞失巢凋亡，導致單細胞存活率顯著下降,。一方面,，抑制細胞失巢凋亡的產(chǎn)生，會改善單細胞存活率；另一方面,，溫和的自動化分選系統(tǒng)可以進一步優(yōu)化陽性單克隆細胞的篩選平臺,。

在此研究中，使用Cytena 單細胞打印機展示了一個具有代表性的高效分選iPSC的工作流程,。分選過程中通過捕捉噴嘴圖片證實單細胞來源,，單細胞鋪板效率＞95%（圖2）；一塊96孔板獲得68個單克隆孔（圖3）,；使用mTeSR/E8進行重懸,，在基質(zhì)膠的選擇中，使用MG可以顯著提高iPSC單細胞恢復率,；四組分CEPT處理后的iPSC克隆有效率更高（圖4）,，且不會引起遺傳異常。

Cytena單細胞打印機的高效的微流控細胞分選,，搭配小分子混合物CEPT的工作流程,，一方面提升了iPSC的單克隆效率，同時單克隆又保持了原有的形態(tài)學特點,，這一工作流程將突破現(xiàn)有的技術瓶頸成為新的標準流程,，能滿足后續(xù)的單克隆iPSC主細胞庫（MCB）的建立需求，用于日后的可持續(xù)供應和穩(wěn)定的生產(chǎn)流程,。

參考文獻:

1.Vallone et al. Methods for Automated Single Cell Isolation and Sub-Cloning of Human Pluripotent Stem Cells, Current Protocols in Stem Cell Biology e123, Volume 55(2020).

2.Chen Y , Carlos A. T , Chen L,et al. A Versatile Polypharmacology Platform Promotes Cytoprotection and Viability of Human Pluripotent and Differentiated Cells. Nat Methods. 18(5), 528–541(2021).

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