硝酸還原酶（Nitrate Reductase,，NR）活性測定試劑盒說明書

                                     微量法100管/96樣

注    意：正式測定前務(wù)必取2-3個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定

測定意義：

NR（ EC 1.7.1.3）廣泛存在于植物中，是植物硝態(tài)氮轉(zhuǎn)化為氨態(tài)氮的關(guān)鍵酶,，也是誘導(dǎo)酶,，對作物的產(chǎn)量和品質(zhì)有影響。

測定原理：

NR催化硝酸鹽還原為亞硝酸鹽,，NO3ˉ +NADH+H^＋→ NO2ˉ +NAD^＋ +H ₂ O,；產(chǎn)生的亞硝酸鹽能夠在酸性條件下，與對–氨基苯磺酸及 α - 萘胺定量生成紅色偶氮化合物,；生成的紅色偶氮化合物在 540 nm 有最大吸收峰,，可用分光光度法測定。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計/酶標(biāo)儀,、水浴鍋,、臺式離心機、可調(diào)式移液器,、微量石英比色皿/96孔板,、研缽、冰和蒸餾水,。

試劑的組成和配制：

誘導(dǎo)劑儲備液：液體50mL×1瓶,，4℃保存。

提取液：液體60mL×1瓶,，4℃保存,。

試劑一：液體10mL×1瓶，-20℃保存,。

試劑二：液體5mL×1瓶,，-20℃保存； 

試劑三：液體6mL×1瓶,，4℃保存（如出現(xiàn)結(jié)晶析出,，60℃-90℃水浴溶解后使用）；

試劑四：液體6mL×1瓶,，4℃保存,。

試劑五：標(biāo)準(zhǔn)儲備液1mL，-20℃保存,。

誘導(dǎo)劑應(yīng)用液的配制：用時將誘導(dǎo)劑儲備液稀釋10倍,，即取10mL誘導(dǎo)劑儲備液加90mL蒸餾水，充分混勻,。

0.1umol/mL的標(biāo)準(zhǔn)液的配制：用時將試劑五稀釋100倍,，即取 0.1ml試劑五加9.9mL蒸餾水，充分混勻。

樣本前處理：

動植物組織樣品的前處理:

（1）取適量誘導(dǎo)劑于燒杯中,，將新鮮標(biāo)本洗凈,，濾紙吸干，放入誘導(dǎo)劑應(yīng)用液中（淹沒即可）,，浸泡2h,，取出樣本，濾紙吸干,。

（2）按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液）,，進行冰浴勻漿,。8000g 4℃離心10min，取上清,，置冰上待測,。

注意：

1、 建議使用新鮮沒有冷凍過的樣本,。

2,、 一般不要誘導(dǎo)處理，預(yù)測定結(jié)果沒有活性（A測定≤A對照管）則需要誘導(dǎo)處理,。

細菌或培養(yǎng)細胞的前處理：

先收集細菌或細胞到離心管內(nèi),，離心后棄上清；按照細菌或細胞數(shù)量（10⁴個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細菌或細胞加入1mL提取液）,，超聲波破碎細菌或細胞（冰浴,，功率20％或200W，超聲3s,，間隔10s,，重復(fù)30次）；8000g 4℃離心10min,，取上清,，置冰上待測。

測定步驟：

1,、分光光度計或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上,，調(diào)節(jié)波長至540nm，蒸餾水調(diào)零,。

2,、樣本測定（在EP管或96孔板中加入下列試劑）

     混勻后，37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）反應(yīng)30min

混勻,，25℃室溫顯色20min,，540nm處比色

注意：1、標(biāo)準(zhǔn)管和空白管只需測一次，每個測定管設(shè)一個對照管,。

       2,、誘導(dǎo)處理后的樣本對照管中試劑二改成加25μL蒸餾水。

NR活性計算：

（1）按樣本鮮重計算：

單位定義：每小時每g鮮重樣品中催化產(chǎn)生 1μmol NO2ˉ的量為一個 NR活力單位,。

NR（μmol/h/g 鮮重）= (C標(biāo)準(zhǔn)管×V1)×（A測定管-A對照管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管）÷(W×V1÷V2)÷T=0.2×（A測定管-A對照管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管）÷W

（2）按樣本蛋白濃度計算：

單位定義：每小時每mg組織蛋白催化產(chǎn)生 1μmol NO2ˉ的量為一個 NR活力單位,。

NR（μmol/h/mg prot）=(C標(biāo)準(zhǔn)管×V1)×（A測定管-A對照管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管）÷(V1×Cpr)÷T=0.2×（A測定管-A對照管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管）÷Cpr

C標(biāo)準(zhǔn)管：標(biāo)準(zhǔn)管濃度，0.1μmol/mL,；V1：加入樣本體積：0.02mL,；V2：加入提取液體積，1mL,；T：反應(yīng)時間,，0.5h；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度,，mg/mL,；W：樣本鮮重，g,。