早在1976年,，德國科學(xué)家Frieden Stein和他的同事在骨髓中發(fā)現(xiàn)了間充質(zhì)干細胞（MSCs）,，后來的研究者發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細胞（Mesenchymal Stem Cell,，MSC)是一種具有自我更新能力和多向分化潛能的成體干細胞,，在特定的誘導(dǎo)條件下,，能夠分化成不同類型的細胞,，包括成骨細胞,、脂肪細胞,、軟骨細胞,、肌細胞、神經(jīng)細胞等,，而且沒有醫(yī)學(xué)倫理的困擾,，所以受到科學(xué)家的青睞，被廣泛應(yīng)用于組織再生,、器官修復(fù),、血液病、癌癥治療等領(lǐng)域,。

MSC的體外培養(yǎng)擴增不可避免地經(jīng)歷復(fù)制性衰老,，伴隨著基因組不穩(wěn)定性,，這是MSC細胞治療行業(yè)一個嚴重的障礙。此外,，因為接種起始MSC細胞濃度不一樣,，即使經(jīng)過相同的擴增代數(shù)，細胞的復(fù)制周期是不一致的,，導(dǎo)致批次間生產(chǎn)的MSC細胞的穩(wěn)定性差,，這也是目前MSC細胞在治療行業(yè)的一個瓶頸。 因此通過單一MSC細胞來源的穩(wěn)定細胞株為提供可持續(xù)的,、穩(wěn)定的MSC細胞生產(chǎn)成為關(guān)鍵,，可以助力MSC干細胞治療行業(yè)的快速發(fā)展。

為什么要挑選MSC細胞的單克隆細胞株,？

細胞單克隆性,，一般指用于建立最初的種子庫細胞為單個細胞來源。藥物生產(chǎn)過程中,，具有單克隆源性的細胞庫能夠更好地保持產(chǎn)品批次之間的質(zhì)量一致性,，因此在三級細胞庫建立過程中細胞的來源一致性尤為重要；這一點也是預(yù)防種子庫細胞變異的風險的關(guān)鍵,，也可更好的對上游工藝開發(fā)和下游產(chǎn)品質(zhì)量的把控,。

相反的，多克隆細胞系構(gòu)建成功后不同細胞克隆生長速度不一致,，目的基因表達量比較低的細胞克隆增殖速度一般更快,，因此在最初的10代左右會觀察到表達量逐漸下降，且不能長期維持細胞表型,。

考慮到產(chǎn)品安全性,，FDA的政策和法規(guī)都要求生物制藥企業(yè)提供清晰圖片證據(jù)，用以證明生產(chǎn)用的細胞株的單克隆源性,。

本文詳細介紹了利用Cytena公司開發(fā)的單細胞打印技術(shù)(SCP technology)，通過將單個的MSC細胞自動分離到標準的96/384孔板中,，大大加速MSC單克隆細胞株的開發(fā),。

材料與方法

1、細胞類型：貼壁的間充質(zhì)干細胞（Mesenchymal Stem Cell,，MSC）,。

2、樣品處理方法：

1)   用胰酶消化處理MSC細胞,，變成懸浮細胞,；

2)   用biosharp DMEM低糖培養(yǎng)基清洗重懸細胞，用40 μm的篩網(wǎng)過濾樣品,，去除細胞團塊,；

3)   按照7E5cells/ml的密度,，將細胞加入一次性的分選芯片中。

3,、分選工具：德國Cytena單細胞打印機F.SIGHT 2.0和一次性Catridge

圖1：克隆篩選單細胞打印系統(tǒng)分選流程圖（single-cell printer™,，scp™）

結(jié)果

表1是通過SCP^TM和手動-LD方法分選的多塊96孔細胞培養(yǎng)板的統(tǒng)計結(jié)果，我們可以發(fā)現(xiàn)SCP^TM分選的D0單細胞率是手動-LD的4倍,，在培養(yǎng)15天后統(tǒng)計“單克隆率”發(fā)現(xiàn)是手動-LD的3.67倍之多(表2),！

表1：MSC細胞單細胞率統(tǒng)計表

由于MSC細胞是貼壁細胞，細胞的結(jié)團率比較高,，所以MSC的單細胞率不像懸浮類細胞的高（CHO單細胞率可以達95%以上）,，但是相比于平行的有限稀釋法來說，單細胞率也提高了近4倍,，提高了單克隆的篩選效率,。

表2：MSC細胞單克隆率統(tǒng)計表

采用一次性的微流控芯片進行單細胞分選，每次只產(chǎn)生約150pL的液滴,，單細胞率高,。無菌的一次性的芯片可以避免項目之間的交叉污染，設(shè)備無需清洗和驗證,，有利于日后項目的申報審批,。

圖2：微流控Cartridge芯片（150pL/單液滴體積）

討論

單細胞率是決定單克隆率高低的關(guān)鍵性因素，因此為尋求最適MSC貼壁樣品篩選條件,，我們做了以下測試：

• 板A1-3篩選圓度范圍為0.5-1,，板A4縮小圓度范圍為0.7-1，直徑范圍均為15-25μm,。

• 表1中“手工-LD”部分結(jié)果包括多克隆團,，因此表2中 LD方法“D15單克隆率 < 20%”。

Cytena克隆篩選單細胞打印系統(tǒng)（single-cell printer™,，scp™）采用設(shè)計的芯片,，能溫和、高效,、快速的分選,，既保證了D0高的單細胞率，又結(jié)合了高分辨率的光學(xué)系統(tǒng),，留下單細胞分選的“印跡”,，通過設(shè)置細胞的直徑、細胞圓度,、細胞熒光強度等質(zhì)控方式,，分選出“強壯”的細胞，利于后期克隆恢復(fù)，獲得高的單克隆率,。

結(jié)論

SCP^TM所獲得貼壁的MSC單克隆率是手工-LD的3.67倍多,！分選條件設(shè)置為：圓度范圍在0.5-1，直徑范圍在15-25μm,，更適合于MSC樣品的單細胞篩選,！這也說明了SCP^TM可以很好的應(yīng)用于MSC單克隆細胞株的篩選，助力于MSC細胞在細胞治療,、基因治療,、組織工程以及再生醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的發(fā)展！