分光光度計是一類很重要的分析儀器,無論在物理學(xué),、化學(xué)、生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、材料學(xué)、環(huán)境科學(xué)等科學(xué)研究領(lǐng)域,還是在化工、醫(yī)藥、環(huán)境檢測,、冶金等現(xiàn)代生產(chǎn)與管理部門,紫外可見分光光度計督有廣泛而重要的應(yīng)用。分光光度計就是利用分光光度法對物質(zhì)進行定量定性分析的儀器,，常用于核酸,，蛋白定量以及細菌生長濃度的定量。

　　超微量分光光度計已成為現(xiàn)代分子生物實驗室常規(guī)儀器,。常用于核酸,，蛋白定量以及細菌生長濃度的定量。核酸的定量是超微量分光光度計使用頻率最高的功能,?？梢远咳苡诰彌_液的寡核苷酸，單鏈,、雙鏈DNA,，以及RNA,。核酸的最高吸收峰的吸收波長260nm。每種核酸的分子構(gòu)成不一,，因此其換算系數(shù)不同,。定量不同類型的核酸，事先要選擇對應(yīng)的系數(shù),。如：1OD的吸光值分別相當于50μg/ml的dsDNA,，37μg/ml的ssDNA，40μg/ml的RNA,，30μg/ml的Olig,。測試后的吸光值經(jīng)過上述系數(shù)的換算，從而得出相應(yīng)的樣品濃度,。測試前，選擇正確的程序,，輸入原液和稀釋液的體積,，爾后測試空白液和樣品液。然而,，實驗并非一帆風(fēng)順,。讀數(shù)不穩(wěn)定可能是實驗者最頭痛的問題。靈敏度越高的儀器,，表現(xiàn)出的吸光值漂移越大,。

　　事實上，分光光度計的設(shè)計原理和工作原理,，允許吸光值在一定范圍內(nèi)變化,，即儀器有一定的準確度和精確度。如德國伯赫Colibri超微量分光光度計的準確度≤1.0%（1A）,。這樣多次測試的結(jié)果在均值1.0%左右之間變動,，都是正常的。另外,，還需考慮核酸本身物化性質(zhì)和溶解核酸的緩沖液的pH值,，離子濃度等：在測試時，離子濃度太高,，也會導(dǎo)致讀數(shù)漂移,，因此建議使用pH值一定、離子濃度較低的緩沖液,，如TE,，可大大穩(wěn)定讀數(shù)。樣品的稀釋濃度同樣是不可忽視的因素：由于樣品中不可避免存在一些細小的顆粒,，尤其是核酸樣品,。這些小顆粒的存在干擾測試效果,。為了程度減少顆粒對測試結(jié)果的影響，要求核酸吸光值至少大于0.1A,，吸光值最好在0.1-1.5A,。在此范圍內(nèi)，顆粒的干擾相對較小,，結(jié)果穩(wěn)定,。從而意味著樣品的濃度不能過低，或者過高（超過光度計的測試范圍）,。最后是操作因素,，如混合要充分，否則吸光值太低,，甚至出現(xiàn)負值,；混合液不能存在氣泡，空白液無懸浮物,，否則讀數(shù)漂移劇烈,；必須使用相同的比色杯測試空白液和樣品，否則濃度差異太大,；換算系數(shù)和樣品濃度單位選擇一致,；不能采用窗口磨損的比色杯；樣品的體積必須達到比色杯要求的最小體積等多個操作事項,。

　　除了核酸濃度,，分光光度計同時顯示幾個非常重要的比值表示樣品的純度，如A260/A280的比值,，用于評估樣品的純度,，因為蛋白的吸收峰是280nm。純凈的樣品,，比值大于1.8（DNA）或者2.0（RNA）,。如果比值低于1.8或者2.0，表示存在蛋白質(zhì)或者酚類物質(zhì)的影響,。A230表示樣品中存在一些污染物,，如碳水化合物，多肽,，苯酚等,，較純凈的核酸A260/A230的比值大于2.0。A320檢測溶液的混濁度和其他干擾因子,。純樣品,，A320一般是0。蛋白質(zhì)通常是多種蛋白質(zhì)的化合物,，比色法測定的基礎(chǔ)是蛋白質(zhì)構(gòu)成成分：氨基酸（如酪氨酸,，絲氨酸）與外加的顯色基團或者染料反應(yīng),，產(chǎn)生有色物質(zhì)。有色物質(zhì)的濃度與蛋白質(zhì)反應(yīng)的氨基酸數(shù)目直接相關(guān),，從而反應(yīng)蛋白質(zhì)濃度,。

　　比色方法一般有BCA，Bradford,，Lowry等幾種方法,。

　　Lowry法：以最早期的Biuret反應(yīng)為基礎(chǔ)，并有所改進,。蛋白質(zhì)與Cu2反應(yīng),，產(chǎn)生藍色的反應(yīng)物。但是與Biuret相比,，Lowry法敏感性更高,。缺點是需要順序加入幾種不同的反應(yīng)試劑；反應(yīng)需要的時間較長,；容易受到非蛋白物質(zhì)的影響,；含EDTA，Tritonx-100,，ammoniasulfate等物質(zhì)的蛋白不適合此種方法。

　　BCA（Bicinchoninineacidassay）法：這是一種較新的,、更敏感的蛋白測試法,。要分析的蛋白在堿性溶液里與Cu2反應(yīng)產(chǎn)生Cu，后者與BCA形成螯合物,，形成紫色化合物,，吸收峰在562nm波長。此化合物與蛋白濃度的線性關(guān)系,，反應(yīng)后形成的化合物非常穩(wěn)定,。相對于Lowry法，操作簡單,，敏感度高,。但是與Lowry法相似的是容易受到蛋白質(zhì)之間以及去污劑的干擾。

　　Bradford法：這種方法的原理是蛋白質(zhì)與考馬斯亮蘭結(jié)合反應(yīng),，產(chǎn)生的有色化合物吸收峰595nm,。其最大的特點是，敏感度好,，是Lowry和BCA兩種測試方法的2倍,；操作更簡單，速度更快,；只需要一種反應(yīng)試劑,；化合物可以穩(wěn)定1小時,，方便結(jié)果；而且與一系列干擾Lowry,，BCA反應(yīng)的還原劑（如DTT,，巰基乙醇）相容。但是對于去污劑依然是敏感的,。最主要的缺點是不同的標準品會導(dǎo)致同一樣品的結(jié)果差異較大,，無可比性。

　　某些初次接觸比色法測定的研究者可能為各種比色法測出的結(jié)果并不一致,，感到迷惑,，究竟該相信哪種方法？由于各種方法反應(yīng)的基團以及顯色基團不一,，所以同時使用幾種方法對同一樣品得出的樣品濃度無可比性,。例如：Keller等測試人奶中的蛋白，結(jié)果Lowry,，BCA測出的濃度明顯高于Bradford,，差異顯著。即使是測定同一樣品,，同一種比色法選擇的標準樣品不一致,，測試后的濃度也不一致。如用Lowry測試細胞勻漿中的蛋白質(zhì),，以BSA作標準品,，濃度1.34mg/ml，以a球蛋白作標準品,，濃度2.64mg/ml,。因此，在選擇比色法之前,，最好是參照要測試的樣本的化學(xué)構(gòu)成,，尋找化學(xué)構(gòu)成類似的標準蛋白作標準品。另外,，比色法定量蛋白質(zhì),，經(jīng)常出現(xiàn)的問題是樣品的吸光值太低，導(dǎo)致測出的樣品濃度與實際的濃度差距較大,。關(guān)鍵問題是,，反應(yīng)后1011分光光度計的重要配件——比色杯的顏色是有一定的半衰期，所以每種比色法都列出了反應(yīng)測試時間,，所有的樣品（包括標準樣品）,，都必須在此時間內(nèi)測試。時間過長，得到的吸光值變小,，換算的濃度值降低,。除此，反應(yīng)溫度,、溶液PH值等都是影響實驗的重要原因,。此外，非常重要的是,，最好是用塑料的比色法,。避免使用石英或者玻璃材質(zhì)的比色杯，因為反應(yīng)后的顏色會讓石英或者玻璃著色,，導(dǎo)致樣品吸光值不準確,。實驗室確定細菌生長密度和生長期，多根據(jù)經(jīng)驗和目測推斷細菌的生長密度,。在遇到要求較高的實驗,，需要采用分光光度計準確測定細菌細胞密度。OD600是追蹤液體培養(yǎng)物中微生物生長的標準方法,。以未加菌液的培養(yǎng)液作為空白液,，之后定量培養(yǎng)后的含菌培養(yǎng)液。為了保證正確操作,，必須針對每種微生物和每臺儀器用顯微鏡進行細胞計數(shù),，做出校正曲線。實驗中偶爾會出現(xiàn)菌液的OD值出現(xiàn)負值,，原因是采用了顯色的培養(yǎng)基,，即細菌培養(yǎng)一段時間后，與培養(yǎng)基反應(yīng),，發(fā)生變色反應(yīng)。另外,，需注意的是,，測試的樣品不能離心，保持細菌懸浮狀態(tài),。