植物RNA提取試劑盒的操作步驟與應(yīng)用！

一,、背景

植物RNA提取試劑盒用于從各種植物中提取純化高品質(zhì)總RNA，也適用于真菌菌絲RNA的提取,。的Shredder分離柱,，用于勻質(zhì)化和過濾高粘度的植物或真菌裂解物，同時采用硅基質(zhì)膜吸附RNA進行純化,，使多聚糖等各種污染物通過洗滌被有效去除,，經(jīng)洗脫的RNA可直接用于各種下游實驗。由本試劑盒提取RNA分子量大于200堿基,，純度高，幾乎無DNA殘留,。如果是對微量DNA非常敏感的RNA實驗,，殘留的DNA可利用無RNase的DNase在柱上進行消化去除。提取的RNA可用于Northern Blot,、Dot Blot,、RT-PCR和體外翻譯等實驗。

二,、操作步驟

1,、50-100 mg植物組織在液氮中迅速研磨成粉末，加入600μl Buffer RL(使用前檢查是否加入β-巰基乙醇)或Buffer RLC,。渦旋振蕩使其充分裂解,。

2、將步驟1所得全部液體轉(zhuǎn)移至已裝入收集管的過濾柱中,，12000rpm(~～13400×g)離心2分鐘,，將收集管中的上清液轉(zhuǎn)移到一個新的離心管(自備)中。

3、在步驟2所得干凈的裂解液中加入0.5倍體積的無水乙醇,，迅速混勻,。

注意：加入乙醇后可能會產(chǎn)生沉淀，但不影響后續(xù)試驗,。

4,、將上步得到的溶液轉(zhuǎn)移到已裝入收集管的吸附柱中,若一次不能將全部溶液加入吸附柱中，請分兩次轉(zhuǎn)入;12000rpm離心15秒,，棄掉廢液,，將吸附柱重新放回收集管中。

5,、向吸附柱中加入350μl Buffer RW1,，12000rpm離心1分鐘，棄廢液,，將吸附柱重新放回收集管中,。

6、配制DNase I混合液：取52μl RNase-Free Water,，向其中加入8μl 10×Reaction Buffer和20μl DNase I(1 U/μl),，混勻，配制成終體積為80μl的反應(yīng)液,。

7,、向吸附柱中直接加入80μl DNase I混合液，20-30℃孵育15分鐘,。

8,、向吸附柱中加入350μl Buffer RW1,12000rpm離心1分鐘，棄廢液,，將吸附柱重新放回收集管中,。

9、向吸附柱中加入500μl Buffer RW2(使用前檢查是否加入無水乙醇),12000rpm離心15秒,棄廢液,。

10,、重復(fù)步驟9。

11,、將吸附柱放回收集管中,，12000rpm離心1分鐘，將吸附柱置于室溫數(shù)分鐘,，以*晾干吸附柱中的無水乙醇,。

12、將吸附柱裝入新的離心管中,，向吸附膜的中間加入30-50μl RNase-Free Water,，室溫放置1分鐘,，12000rpm離心1分鐘，得到的RNA溶液保存在-70℃,，防止降解,。

三、應(yīng)用

用于馬鈴薯病毒快速檢測技術(shù)的建立與應(yīng)用研究：

馬鈴薯病毒病是重要的馬鈴薯病害,，每年均造成嚴重的經(jīng)濟損失,。目前，生產(chǎn)和利用脫毒種薯是防治馬鈴薯病毒病的重要方法,，快速,、準(zhǔn)確的馬鈴薯病毒檢測技術(shù)是保證脫毒種薯質(zhì)量的關(guān)鍵。

研究依據(jù)馬鈴薯Y病毒（PVY）,、馬鈴薯A病毒（PVA）,、馬鈴薯S病毒（PVS）、馬鈴薯卷葉病毒（PLRV）基因序列設(shè)計合成了4對具毒特異性的引物,。利用病毒特異性引物,，以帶有不同病毒的馬鈴薯樣本總RNA為模板分別進行RT-PCR擴增，獲得了4條DNA片段,，將4條DNA片段與克隆載體連接后轉(zhuǎn)入大腸桿菌進行序列測定,，對測序結(jié)果進行分析證明PCR擴增所得DNA片段確為目標(biāo)病毒相應(yīng)的目的基因片段（核苷酸同源性達到99%以上）。

利用4對病毒特異性引物建立了4種病毒的常規(guī)RT-PCR檢測技術(shù),。對馬鈴薯病毒RT-PCR檢測技術(shù)中RNA的提取方法進行了改進,，以解決由于馬鈴薯塊莖淀粉含量過高而導(dǎo)致利用常規(guī)的植物RNA提取試劑盒無法提出塊莖RNA的問題。首先研究開發(fā)出一套新的馬鈴薯塊莖總RNA提取方法,，利用此方法制備的RNA*符合后續(xù)進行馬鈴薯病毒RT-PCR檢測的要求,，而該方法更為快速、簡便,，且成本低廉,，適用于大量樣品的提取檢測。

在此基礎(chǔ)上,，又研制開發(fā)了一種新型緩沖溶液，在進行病毒檢測時,，將馬鈴薯塊莖組織在此緩沖溶液中研磨勻漿后,，即可直接進行RT-PCR檢測，不需進行馬鈴薯塊莖RNA的提取,，因此,，該方法操作更加簡便，檢測效率更高,，成本更低,。該方法在國內(nèi)尚未見報道,。

對馬鈴薯病毒RT-PCR檢測技術(shù)的反應(yīng)體系及反應(yīng)程序進行了改進。利用PVS,、PVY,、PVA的特異性引物建立了可對3種病毒進行同步檢測的三重RT-PCR檢測技術(shù)，并對PCR反應(yīng)中的MgCl2的濃度進行優(yōu)化,，結(jié)果表明,，當(dāng)MgCl2濃度為5.5mmol/L時，PCR檢測,。

此方法更為快速,、簡便、高效,。采用所建立的病毒檢測技術(shù)對河南省和黑龍江省部分脫毒試管苗和脫毒種薯進行了檢測,，結(jié)果表明，河南省的樣本中檢出率的為PVY,，其次是PVA,；黑龍江省的樣本中檢出率的是PVS、其次是PLRV,。采用所建立的病毒檢測技術(shù)對我國部分馬鈴薯產(chǎn)區(qū)中馬鈴薯病毒病發(fā)生情況進行了調(diào)查,。